边疆少数民族彝族人群rs1333049单核苷酸多态性与冠心病的联系*

刘 斌，张 敏，李显刚，林仁华，杨 洁，张 亮，何 跃，王显昆，潘娅楠

昆明医科大学第五附属医院/红河州滇南中心医院：1.心血管内科；2.医学检验科，云南个旧 661000

冠心病是炎症介导、多种细胞因子参与，以冠状动脉血管平滑肌内膜损伤和脂质沉积为病变基础的动脉粥样硬化缺血性心脏病，其受遗传和环境因素的交互影响，并表现出地域、民族和种族差异[1]。染色体9p21上rs1333049 单核苷酸多态性(SNP)与冠心病有关联[2]，但不同地域、不同民族间，民俗习惯、饮食结构、疾病普及遗传基因有差异[3]，冠心病易感基因可能存在民族地域特征。云南省有25个少数民族，其中彝族人口数量最多，彝族群体以大杂居小聚居的居住方式零星分布于云南的各个地州，其中80%居住在高寒山区，彝族人群独特的居住环境及民俗习惯可能与冠心病的发生有联系，但目前国内外少见相关报道。本研究以中国少数民族种类最丰富的云南省为例，选取云南省少数民族人口数量最多的彝族人群作为研究对象，探讨云南边疆红河哈尼族彝族自治州(以下简称红河州)彝族人群染色体9p21上rs1333049 SNP与冠心病的联系，并分析彝族冠心病的易感基因型，以了解多民族聚集区彝族人群冠心病的影响因素及易感基因，为少数民族冠心病的预防、控制及基因诊断提供参考资料，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年4月至2020年12月在昆明医科大学第五附属医院住院的120例年龄>18岁，3代以内无不同民族间通婚，且居住在红河州范围内的非直系世居彝族人群作为研究对象，其中男65例，女55例，平均年龄(56.83+10.29)岁。选取经冠状动脉造影检查为阳性的60例作为冠心病组，男性占比58.3%，平均年龄(58.62±9.05)岁，纳入标准满足所有条件或者(1)/(2)+(3):(1)有心悸、胸闷/胸痛等临床症状；(2)心电图有ST-T段心肌缺血改变；(3)冠状动脉造影检查证实主要供血冠状动脉管腔狭窄≥50%。按照性别年龄匹配，连续入选同期经临床及冠状动脉造影检查排除了冠心病的彝族非冠心病患者60例作为对照组，男性占比50.0%，平均年龄(55.05±11.19)岁。排除标准：非世居彝族、有全身免疫功能障碍、恶性肿瘤、严重肝肾功能障碍、合并严重感染、急性消化道出血、严重贫血、精神行为异常者。收集纳入研究对象的性别、年龄、居住地、既往史、个人史、血压[收缩压(SBP)、舒张压(DBP)]等基本信息，以及总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FBG)、同型半胱氨酸(Hcy)等指标和冠状动脉造影检查等结果。本研究通过昆明医科大学第五附属医院伦理委员会批准,所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2相关诊断标准 高血压[4]、糖尿病[5]的诊断依据临床诊治期间我国最新的临床指南为标准；吸烟、饮酒史为有相应嗜好1年以上，吸烟：>100支/年,饮酒：每天饮用酒精量(g)男性、女性分别为>25 g、>15 g，酒精量(g)=饮酒总量(mL)×含酒精浓度(%)×0.8。血脂、血糖等生化指标为患者空腹>8 h采血，经定期室间质控及每天室内质控合格的AU5800生化分析仪(美国)检测。

1.3样本量的估算 本研究依据云南省玉溪市报道的彝族冠心病人群染色体9p21上rs1333049基因分布的频率[6]，以基因型频率占比最高(47%)的CG基因型、CG+GG基因型频率占比为77%，结合前期对昆明医科大学第五附属医院住院的彝族冠心病患病率的估算及rs1333049基因分布频率的初步分析，以频率最高(45%左右)的G等位基因、CG+GG基因型的累积频率占70%左右，检验效能=0.8，检验水准α=0.05,1-α=0.95,根据PASS15.0样本量估算软件计算的样本量为58例，失访率按照5%计算，样本量为每组各61例，取整数每组各60例。

1.4方法

1.4.1血液样本收集 采集符合纳入标准人群的静脉血2 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝采血管收集后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.4.2血液样本DNA提取 采用Qiagen血液DNA提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取全血DNA，采用UV-IV紫外分析仪(北京市新技术应用研究所生产)检测A260/A280，若A>1.8为纯度达标(>90%)，DNA样本保存备用。

1.4.3rs1333049基因分型 染色体9p21上rs1333049基因分型采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)，引物设计用PrimerPremier6.0软件完成，G等位基因5′到3′方向正向DNA序列：ATCATACCCGAA GTAGAGC，反向引物序列：TTGTTGAACAATTTCCCTA。以1.0 μmol/L的引物采用BIO-RAD公司生产的PTC-200 PCR仪进行基因扩增，PCR产物采用DYY-8C电泳仪进行检测，纯化的PCR产物用ABI3730XL型DNA测序仪(Applied Biosystems公司)进行基因分型，所有操作严格遵循标准操作规程，用chromas.exe软件读取基因测序的峰图。

1.5数据收集 收集个人基本信息，从医院信息系统调取住院患者入院第2天空腹血的血生化指标，冠状动脉造影结果录入自建的EpiDataV3.1冠状动脉数据库。

2 结 果

2.1等位基因Hardy-Weinberg平衡检验 冠心病组和对照组rs1333042 SNP等位基因频率采用Hardy-Weinberg平衡χ2检验，P>0.05，表示样本的民族群体代表性好。

2.2两组人群基线资料比较 冠心病组和对照组人群高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、FBG及rs1333042基因型比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而年龄、男性、居住农村、SBP、DBP、LDL-C、HDL-D、TG、TC、Hcy及rs1333049等位基因比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 冠心病组和对照组基线资料比较[n(%)或或M(Q1,Q3)]

组别nDBP(mm Hg)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FBG(mmol/L)Hcy(mmol/L)对照组6085.42±22.192.81±0.801.17±0.301.43(1.14,2.55)4.64±0.995.35±0.8612.42(10.50,16.14)冠心病组6083.98±14.352.98±0.941.11±0.331.73(0.99,2.23)4.63±1.436.44±2.0112.65(10.90,15.52)χ2/t/Z0.420-1.0901.071-0.0940.054-3.853-0.228P0.6750.2780.2860.9250.957<0.0100.819

组别nrs1333049基因型CCCGGGrs1333049等位基因CG对照组6017(28.3)22(36.7)21(35.0)56(46.7)64(53.3)冠心病组609(15.0)35(58.3)16(26.7)53(44.2)67(55.8)χ2/t/Z6.1020.151P0.0470.679

2.3彝族人群染色体9p21上rs1333049的基因分布特征 冠心病组rs1333049的CG基因型频率(58.3%)高于对照组(36.7%)，而CC及GG基因型频率均低于对照组(15.0%vs.28.3%、26.7%vs.35.0%)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1；而不同性别人群rs1333049的CC、CG、GG基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图2；不同年龄(≤45岁、>45～65岁、>65岁)人群rs1333049的CC、CG、GG基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图1 两组彝族人群rs1333049基因型频率比较

图2 彝族不同性别人群rs1333049基因型频率比较

图3 彝族不同年龄人群rs1333049基因型频率比较

2.4彝族冠心病主要危险因素分析 采用多因素Logistic回归分析将冠心病相关因素：性别、年龄、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、LDL-C、表1中差异有统计学意义的FBG及染色体9p21上rs1333049基因型(CC、CG、GG)赋值后纳入回归分析模型，因变量为是否为冠心病，冠心病赋值1，非冠心病(对照组)赋值0。结果显示，年龄(OR=1.054，95%CI：1.009～1.101)、FBG(OR=1.741，95%CI：1.156～2.623)、rs1333049的CG基因型(OR=4.160，95%CI：1.399～12.370)为彝族冠心病的影响因素(P<0.05)。见表2。

表2 彝族冠心病多因素Logistic回归分析

2.5年龄、FBG诊断彝族冠心病的ROC曲线分析 ROC曲线分析结果显示，年龄>61.5岁，曲线下面积(AUC)=0.615,P=0.029;FBG>6.06 mmol/L,AUC=0.644,P=0.006。年龄、FBG诊断彝族冠心病的灵敏度为分别为45.0%、41.7%，特异度分别为87.3%、89.9%，2项指标联合检测诊断冠心病的AUC=0.719，P<0.001，灵敏度为65.0%，特异度为73.3%。见图4。

图4 年龄、FBG预测彝族冠心病患者的ROC曲线

3 讨 论

冠心病是边疆少数民族地区导致死亡和伤残的主要疾病之一，但目前缺乏大规模的流行病学调查报告。对于彝族等少数民族，因冠心病的诊治费用高[7]、需要长期服药的特点成为边疆脱贫攻坚的难点。冠心病的发病受地域、环境、民族、饮食习惯、生活方式和遗传背景的交互影响[8]。彝族等少数民族冠心病的危险因素及冠心病的相关易感基因是否与其他民族存在差异，相关报道较少。有研究显示，特定基因型的效应大小可能与遗传背景及环境因素密切相关[9]。在北印度人群中，rs1333049 的C/G多态性与冠心病明显相关，CC纯合基因型的频率与冠状动脉严重程度呈正相关[10]。来自英国、比利时和波兰的全球急性冠状动脉事件登记研究共纳入3 247例急性冠脉综合征患者，随访6个月，发现rs1333049位点C等位基因与心肌梗死复发或心源性死亡独立相关(HR=1.49,95%CI：1.03～1.98,P=0.028)[11]。对波兰白种人急性ST段抬高型心肌梗死患者的5年随访研究未发现rs1333049基因型与全因病死率相关，但高危冠心病组rs1333049位点的GG/CG基因型与5年生存率相关(HR=2.3,95%CI：1.2～4.3,P=0.015)[12]；来自中国、韩国、日本3国共20 523例入选病例的荟萃分析也证实rs1333049 SNP与冠心病有关联(OR=1.29，95%CI：1.23～1.36，P=0.001)[13]，但相关研究未探讨少数民族SNP与冠心病的联系。在中国新疆维吾尔族人群中，冠心病易感基因rs1333049以CC基因型及C等位基因为主[14]，昆明汉族[15]与温州汉族[16]均以CG/CC基因型及C等位基因高表达为主。而本研究发现，彝族冠心病CG基因型呈高表达(>50%)，CG基因型是彝族人群冠心病的易感基因型(OR=4.160，95%CI：1.399～12.370)，而两组C、G等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示不同地区、不同民族间基因频率及易感基因型有差异，其原因需进一步研究。

本研究结果显示，性别、年龄、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、LDL-C、FBG及染色体9p21上rs1333049基因型是彝族人群患冠心病的相关因素，以上相关因素与汉族冠心病的相关因素相似，在边疆少数民族彝族人群中，年龄(OR=1.054，95%CI：1.009～1.101)、FBG(OR=1.741，95%CI：1.156～2.623)为冠心病的影响因素，但其单独诊断冠心病的灵敏度、特异度较低，考虑这2项指标为冠心病的非特异性指标，且有交互影响作用。年龄和FBG联合检测预测冠心病的效率有所提升，提示对于边疆少数民族，根据人群年龄，关注患者FBG，可能对冠心病的早期识别和预防有一定意义。

对于多民族聚集的云南边疆少数民族地区，其独特的山区地形、温和的气候条件、丰富多彩的民族文化、频繁的边境商贸人员往来，可能使少数民族集聚区冠心病的易感基因及基因型表现有所不同。本研究结果显示，云南边疆彝族人群rs1333049 SNP符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，提示样本的民族代表性较好。本研究发现，不同性别、不同年龄彝族人群rs1333049的基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。冠心病组CG基因型频率(58.3%)高于对照组(36.7%)，多因素Logistic回归分析校正高血压、糖尿病、吸烟、饮酒后，rs1333049的CG基因型为彝族冠心病的独立危险因素(OR=4.160，95%CI：1.399～12.370，P<0.05)，提示rs1333049的CG基因型与彝族冠心病的发病有关联，相似的研究结论在白种人、黑种人、亚洲黄种人中均得到证实[17]。

彝族人群染色体9p21上rs1333049 SNP与冠心病有关联[18]，但易感基因型与汉族人群有差异，其可能与彝族人群的遗传背景、居住环境、风俗习惯、生活方式、饮食结构和疾病谱有关，但需进一步研究。云南世居彝族80%居住在山区，山区高海拔及相对缺氧的高原环境可能对遗传变异及饮食习惯有影响，本研究未进行探讨，后续研究者可进一步探索。本研究入选的彝族人群均为3代以内不存在非彝族间通婚的情况，以保证同民族间基因遗传的稳定性，但入选人群70%以上居住在农村，其余近30%人群由于城镇化由农村移居城镇，城镇彝族居民的生活方式、饮食结构及行为习惯可能受人口数量最多的汉族人群的影响，其冠心病的易感基因型也可能会随环境及生活方式的改变而发生变化。染色体9p21上rs1333049 C/G 位于 CDKN2B-AS1 的非翻译区，其通过编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKN )2A和CDKN2B或甲基硫腺苷磷酸化酶通路，引起反义非编码RNA的转录抑制、染色质重塑、炎症介导、基因沉默或DNA甲基化[19]，从而引起碱基插入、缺失或突变，加速冠心病易感基因型改变，促进动脉粥样硬化的进程，但确切的分子机制还需进一步研究。

本研究经过严格的试验设计和伦理审查，样本量的估算以前期大量的文献调研并结合实际临床实践为基础，通过专业的PASS15.0软件进行样本量估算；入组者严格按照前瞻性试验设计入组，入组者排除非彝族通婚及家族性遗传病者，入组人群代表性较好。冠心病组所有患者均行冠状动脉造影检查确诊，对照组经临床诊断明确排除冠心病，但由于样本量较小，入选病例可能难免有入组偏倚；对照组并非完全健康人群，基础疾病的交互影响可能成为冠心病的混杂因素；由于样本量有限，且为单中心的少数民族研究，研究结论可能具有地域特征，但对了解多民族聚集区少数民族冠心病的危险因素具有启发作用。世居彝族人群多居住在山区，但入组人群有近30%居住在城镇(由农村移居城镇)，其彝族人群原本的基因背景可能会随着环境、生活方式及行为习惯的改变而发生变化，本研究未进一步分析居住地及生活方式改变等可能引起的基因变异问题，后续可开展多中心、大样本的前瞻性研究，尽可能多地控制可能的混杂因素，使研究更具代表性。