乳及乳制品中食源性致病菌快速检测技术的应用研究进展

赵淑环，王云霞，刘丽君，李翠枝*，吕志勇

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

随着国民经济水平的不断发展和进步，居民生活质量日益提高，家庭饮食结构不断改善，乳制品消费水平呈明显增长趋势[1]。由于乳制品营养丰富，在采集、加工、运输、销售等环节极易被微生物污染，成为其生长繁殖的营养介质，微生物检测是乳制品安全检测中的一项重要内容，其中食源性致病菌的检测又关系到消费者的身体健康和生命安全[2]。食源性病原体是导致食源性疾病的主要原因，在美国每年约有4 800 万例食源性疾病病例（相当于每6 个人中就有1 例），约有128 000 人住院，3 000 人死亡[3-4]。目前，乳制品中常见的食源性致病菌有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌和克罗诺杆菌等[5-8]，多采用传统培养法，依靠传统生化、微生物全自动鉴定仪、实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等方法进行细菌鉴定，传统培养及生化鉴定工作繁琐且耗时长，检测结果往往滞后于生产，无法满足乳制品安全检测高通量、时间短的需求，不能及时为企业提供风险预警，仪器法鉴定虽有效提高了检测效率，但对实验人员和仪器精密度要求较高，且仪器费用昂贵，很难在企业工厂配备和使用。随着乳制品安全问题的日益严重，以及对食源性致病菌低剂量（＜100 CFU/g）检测的需求，致病菌快速检测技术的研究也在不断深化，研究重点是利用可替代传统培养的分析方法，直接评价乳基质中微生物的存在，建立一种灵敏、特异、快速检测乳制品中致病菌的技术，以达到快速检测的目的，对于乳制品行业内部安全监控极为重要[9]。

近年来，基于免疫学、分子生物学和生物传感器的食源性致病菌快速检测技术取得了很大进展。Demirci等[10]从48 头奶牛、65 头山羊、65 头绵羊和53 头驴共收集231 份乳样进行研究，采用ISO6579：2002《食品和动物饲料微生物学-沙门氏菌的水平检测方法》和ISO21567：2004《食品和动物饲料微生物学-志贺氏菌的水平检测方法》、抗菌药敏实验和血清分型之后，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对病原微生物进行物种和亚种区分，5 份羊乳样品（2.16%）呈沙门氏菌属阳性，而通过实时荧光定量PCR（q-PCR）检测发现仅2 份羊乳样品（0.87%）呈沙门氏菌属阳性，并且所有的牛乳样品均不含沙门氏菌属和志贺氏菌属；Ojima-Kato等[11]开发了一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的应变解决方案新型软件，构建了一个准确、可靠的质谱分析数据库，利用S10-spc-alpha操纵子基因编码核糖体蛋白质谱方法来解决李斯特氏菌属的系谱和种类，即单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、威尔斯李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌的精确区分问题，实现物种或血清型水平微生物的全自动鉴定，为受李斯特氏菌属污染的乳制品提供更快的可追溯性分析[12]。本文对食源性致病菌快速检测技术的原理和应用现状进行综述，以期为乳制品中致病菌快速检测技术的发展提供参考。

1 食源性致病菌传统检测技术

乳制品中常见的如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、克罗诺杆菌等致病菌，在自然界中广泛存在，可以通过乳制品加工人员、加工和运输过程污染乳制品，导致乳制品腐败变质和人类食物中毒。按照传统的检测方法，如GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》、GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB 4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》和GB 4789.40—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》等，进行增菌培养、选择性分离、形态观察、生理生化反应、血清学鉴定等步骤需要耗时4～7 d[13-14]，乳制品中的致病菌可被定性或定量检出，但是菌株的分离和鉴别大多依靠肉眼观察，主观性强、准确性低、检验周期长、操作复杂、灵敏度低，容易漏检样品中损伤或低剂量的致病菌，无法满足快速检测和预防致病菌污染的要求。因此，建立一种高特异性、准确、快速的致病菌检测方法对乳制品行业具有重要意义。

2 食源性致病菌快速检测技术

2.1 培养基显色法

显色培养基用于微生物的选择性生长和鉴别，已广泛应用于致病菌的筛选和鉴定。其基本原理是利用病原菌中含有的特异性酶进行培养，将酶的特异性显色底物添加到培养基中，在细菌生长代谢过程中产生的特异性酶分解特异性显色底物后，目标菌形成不同颜色的菌落，从而对目标菌快速进行分离和鉴别。该项技术是将现代化学合成技术、细菌代谢组学与目前尚不可替代的传统方法相结合应用于细菌检验领域的一项新技术。

顾其芳等[15]发现，来自广东环凯生物技术有限公司和法国科马嘉公司的金黄色葡萄球菌显色培养基的灵敏度和特异性均高于Baird-Parker琼脂平板，且对缓慢葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、产色葡萄球菌均有较强的抑制能力。刘成文等[16]用局部显色培养基纯化单核细胞增生李斯特氏菌，对纯单核细胞增生李斯特氏菌和阳性人工污染样品的快速检测表明，在10-3～10-8稀释度下，检出率可达100%，特异性强、灵敏度和准确度高。高珮[17]比较鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌分别接种于沙门氏菌显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂、亚硫酸铋琼脂、酚红煌绿琼脂和HE琼脂的检测效果，结果表明，沙门氏菌显色培养基是检测沙门氏菌的有效方法，可提高检测精度和检测效率。程晓云等[18]根据GB 4789.40—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》对阪崎肠杆菌进行分离和生化鉴定，36 份样品中，检出阪崎肠杆菌2 株，检出率为5.56%，广东环凯生物技术有限公司阪崎肠杆菌显色培养基与法国科马嘉公司阪崎肠杆菌显色培养基的阳性符合率为100%，可疑菌落检出率分别为16.67%和13.89%。以上研究结果显示，针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和阪崎肠杆菌等细菌的显色培养基在检测细菌时，培养24 h后，通过肉眼观察菌落颜色即可对细菌进行定性或定量分析，与传统培养基相比，显色培养基克服了传统培养基在各种细菌分离、鉴别、计数等操作过程中复杂、敏感性低和特异性差的缺点，能够对细菌进行快速筛查和鉴定。但在实际检测过程中，该技术因为一些竞争菌的存在可能会抑制目标菌的生长，造成假阴性结果，所以显色培养技术仍需与其他仪器或检测技术相结合使用，随着未来对微生物特异性生化反应机制研究的深入，将会促进微生物显色培养技术在食源性病原菌检测领域的进一步开发和应用。

2.2 免疫法

免疫检测技术的出现具有快速、简单、有效和特异性强等特点，其高灵敏度、低成本的特点弥补了传统检测方法的固有不足[19]。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、荧光免疫测定（fluorescence immunoassay，FIA）法、胶体金免疫层析（gold immunochromatographic assay，GICA）法和免疫磁珠分离（immunomagnetic separation，IMS）法等免疫学方法已广泛应用于食源性致病菌的快速检测。

2.2.1 ELISA法

ELISA是目前最常用的检测方法，它利用酶标记抗体与微生物细胞表面的特异性抗原发生特异反应，加入酶底物后，由于催化作用底物颜色发生变化，所以可以被检测到[20]。Nouri等[21]发现，直接ELISA法检测牛乳中的金黄色葡萄球菌肠毒素的准确性显著高于电泳、高效液相色谱和夹心ELISA法。周鹤峰等[22]构建了一种阪崎肠杆菌的特异性抗体相关的间接ELISA方法，37 ℃显色10 min后，最终检测灵敏度达到102CFU/mL，该方法具有高效、快速、特异性强的特点，为食品中阪崎肠杆菌的相关检测提供了参考。He Yixin等[23]使用纳米抗体Nb 13制备了ELISA试剂盒，该试剂盒可以检出牛乳中6 CFU/mL的沙门氏菌。ELISA法特异性好、效率高、成本低、检出限可达ng甚至pg水平，并可制成试剂盒，适用于批量样品的分析[24]。乳制品病原微生物检测中，ELISA法有效克服了现有传统微生物检测方法在检测效率方面的缺陷，所用设备简单，在要求微量化、灵敏、便捷等的情况下，ELISA技术与其他技术相比也显示出了极大优势，但同时不可避免也存在一定的局限性，对抗体质量的依赖性高，抗体的制备过程比较复杂，抗原表面决定簇类似常会发生交叉反应，在微生物快检技术发展中较为受限。

2.2.2 FIA法

FIA是免疫学中最早的技术之一，与传统检测方法相比，FIA具有检测速度快、操作简单、自动化程度高、灵敏度高、特异性强等优点，在检测食源性致病菌方面，已经实现了对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、弯曲杆菌和沙门氏菌的快速检测。但是，目前FIA技术仍然存在一定的问题和缺陷，FIA法仅包含形态学和免疫学2 项指标，病原微生物的常规检测需要形态、生化等多方面综合指标，FIA技术在追求快速检测的同时降低了指标的多维性，检验结果较为片面，在菌落形态相似时，因共同抗原容易出现假阳性结果。

2.2.3 GICA法

GICA法是20世纪70年代逐渐建立起来的一种标记技术，它是一种结合纳米技术、免疫分析技术和色谱技术的固相标记免疫分析技术，具有灵敏度高、性能稳定、特异性强、操作简单、适用范围广、成本低等优点，可用于定性或半定量快速检测大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等食源性致病菌，是快速检测领域极具发展潜力的方法之一[25-27]。刘洪贵等[28]用自制多克隆抗体制备免疫胶体金，用于检测牛乳中的金黄色葡萄球菌，灵敏度为1×104CFU/mL。职爱民等[29]研制的胶体金试纸大多用单克隆抗体标记，通常5～15 min即可出结果，结果可以用肉眼判断，灵敏度高、不需要昂贵的仪器、对操作人员要求低、便于携带和现场检验，但不能进行定量检测，适用于乳制品安全领域的快速现场筛查。在致病菌检测过程中，与传统生化鉴定分离方法比较，GICA法操作简单、检测成本低、检测速度快，适用于工厂生产前端，可在预防和即时监测中发挥巨大的作用。

2.2.4 IMS法

IMS作为一种新的免疫学方法，是将免疫学的高度特异性与磁珠独特的磁性相结合而发展起来的一种新技术，涂于磁珠表面的抗体与样品中的目标物结合形成抗原-抗体复合物，在外部磁场的作用下，标记复合体的磁珠进行定向运动，将目标物与样品中的杂质分离，从而达到检测目标物的目的[30]。Bakthavathsalam等[31]将IMS技术与PCR、q-PCR技术结合检测牛乳中的沙门氏菌，检测限为103CFU/mL，检测时间从几天缩短到4 h，并可有效区分伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。IMS技术广泛应用于微生物学及分子生物学领域，适用于不同类型的样品检测，与传统的常规检验方法相比具有显著的优势，能从样品中迅速、有选择性地分离出目的微生物，有效减少背景干扰，提高检测的精准性，还能捕获损伤的靶细菌，筛选结果可以与常规细菌生化方法联用，也可以和显色培养基、荧光PCR及微生物全自动鉴定仪器等方法联用，为食源性致病菌的检测和鉴定提供有效的快速筛选手段。

2.3 分子生物学法

随着分子生物学技术的不断发展，核酸检测技术已成为近年来的研究热点之一，许多核酸检侧方法已应用于食源性病原体的检测，在食源性致病菌的检测和鉴定中发挥着重要作用。目前常用的分子生物学检测技术有PCR和等温扩增技术。

2.3.1 PCR技术

PCR是一种在体外选择性扩增DNA或RNA片段的常用分子生物学方法，由于其具有特异性强、灵敏性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点，在食源性致病菌的快速检测中被广泛应用，如q-PCR、多重PCR技术等。

2.3.1.1 q-PCR技术

q-PCR是在普通PCR反应系统中加入荧光团，整个过程基于荧光信号的积累进行实时监测，在每个周期检测荧光信号的强度，并记录在计算机软件中，通过计算每个样品的循环阈值，最后根据标准曲线对样品中待测成分进行定量分析[32]。根据荧光模式的不同，q-PCR可分为DNA染色法、荧光探针法和化学引物试剂法，前2 种方法应用较为广泛[33]。q-PCR按定量方法可分为绝对定量和相对定量，基于TaqMan探针的q-PCR技术可用于根据生物分布进行成分定量分析，每个q-PCR板包含不同浓度的标准样品和质量控制样品，用于目标DNA拷贝的绝对定量[34]。李聪[35]利用改进的指数富集的配基系统进化技术分别筛选与蜡样芽孢杆菌和志贺氏菌特异性结合的适体，并根据筛选的适体建立了特异性好、灵敏度高、无需制备抗体的适体捕获结合q-PCR检测致病菌的方法。q-PCR方法已较为成熟，其配套仪器及试剂较为全面、试剂成本中等、操作简单、检测灵敏性和特异性较高，但也存在一些缺点，如因目的基因发生突变而导致漏检、低浓度模板的检测结果无法确定、使用标准曲线定量检测时误差较大等，精准定量是q-PCR技术的发展趋势。

2.3.1.2 多重PCR技术

为了实现对多种食源性致病菌的快速、同步检测，一系列多靶点检测技术应运而生，其中，多重PCR法因其高灵敏度和特异性而受到广泛关注[36]。多重PCR是在同一个PCR反应体系中加入2 对以上的引物，然后连续扩增出许多核酸片段的PCR反应，其反应原理、试剂和操作过程与传统PCR相似[37-38]。杨军等[39]根据金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3 种目标菌的保守基因设计多重PCR引物，通过多重PCR检测致病菌，检测限达102CFU/mL，并且反应体系的组分之间没有交叉干扰，对人工污染乳制品盲样进行验证，3 种致病菌检出率为100%，无假阴性。鄢雷娜[40]建立叠氮溴化丙啶-多重PCR法检测乳制品中肠炎沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌和克罗诺杆菌活菌，对经7 h培养后的加标乳制品样本中的肠炎沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌和克罗诺杆菌的检测限为102CFU/mL，且显示出良好的特异性。多重PCR是在同一PCR反应管内定量检测多种病原微生物，可以大大节省时间及试剂耗材，具有显著的高效性和经济性。

2.3.1.3 数字PCR技术

随着高通量技术的发展，数字PCR技术也得到了发展，数字PCR技术中的“数字”是指单个实体中的信号切换，如关闭或打开、激活或不激活、凝结或不凝结、荧光或非荧光等，数字PCR技术是继普通PCR和q-PCR之后的第3代PCR技术，它是一种具有单分子灵敏度的精确核酸定量技术[41]。相对于许多PCR，数字PCR方法更为高效、快速，它将传统PCR与荧光探针技术相结合，将检测样品分为多个液滴，每个液滴上都有相同的PCR扩增，含有荧光靶序列的微滴为阳性，否则记为阴性，然后根据泊松分布统计样品的DNA分子数目与比例，从而实现更灵敏的绝对定量，目前，数字PCR已经实现了牛乳中沙门氏菌的定量分析，检测限为5 CFU/mL，具有显著的定量优势[42]。目前，已建立了多种食源性病原菌的数字PCR技术检测方法，如大肠杆菌O157:H7、副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌等[43-46]。

2.3.2 等温扩增技术

等温扩增作为一种体外核酸扩增技术，其特点是反应过程中温度恒定，借助热台或水浴锅等简单的恒温仪器即可实现扩增，大大降低了成本和对精密温控设备的依赖，已成为PCR扩增的替代方案[47]。徐文文等[48]利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）建立了一种方便、快速、高效、针对不同乳制品中常见食源性致病菌的检测方法，并对LAMP检测引物试剂和仪器在实验室菌株和人工污染的乳制品样品快速筛选中的适用性进行了评价，所选引物试剂只扩增了目标菌株的核酸，其他菌株没有扩增，扩增检测灵敏度均达101fg/μL，采用GB 4789.36—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》、GB 4789.10—2016和LAMP法同时对婴幼儿乳粉和干酪样品进行检测，检测结果完全一致，对发酵乳样品进行检测时，大肠埃希氏菌O157:H7和金黄色葡萄球菌也有较好的检测结果，检测时间不超过30 min。与普通PCR相比，LAMP不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，缩短了检测时间[49-50]。但等温扩增技术存在的问题是在细胞死亡后，从样品中提取的死菌DNA同样能作为模板进行特异性扩增，所以在检测过程中因难以区分死菌和活菌会出现假阳性结果[51]。

2.4 质谱鉴定技术

质谱技术是一种根据离子产生的质谱图确定样品分子组成的分析技术，是一种新的微生物鉴定技术。质谱技术不仅可以对传统的目标分析物进行定性和定量分析，还可以用于快速、准确的细菌鉴定，其原理是质谱仪离子源通过电离作用赋予目标菌高能量，目标菌在吸收能量后被激发，产生强电离效率，载体进入质谱仪后，通过电压的作用加速飞行，由于每个离子具有不同的质荷比，而探测器上捕获的带电粒子所产生的信号信息也不同，细菌的鉴定可以通过与质谱库中的标准图谱数据进行比对来实现[52-54]。质谱法在微生物检测中的应用具有明显的优势，对样品的要求很低，样品可以不进行分离纯化，直接进行测定，精确度高、操作简单、可以实现自动化，同时还具有高灵敏度、高通量及高特异性，因此在微生物检测方面得到了迅速发展[55]。目前，质谱技术已应用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等常见致病菌的分型和鉴定，与传统方法相比分型和鉴定结果一致[56-57]。

3 结 语

综上所述，传统国标法仍是食源性致病菌检测的金标准，但其操作复杂、检测周期长、主观因素多等不足不能满足乳制品行业现代化高速发展的需要。近些年涌现的显色培养技术、免疫法、分子生物学法、质谱鉴定技术等快速检测技术，已在国内外乳制品中得到广泛运用，但仍然无法满足市场需求，针对技术的灵敏度、准确性和稳定性等方面仍存在较大的改进空间。例如：1）培养基显色技术因非目标菌的竞争作用和特异性酶反应，常会造成检测结果假阴性和假阳性，降低显色培养基的灵敏性和特异性；2）免疫检测技术具有灵敏度高、重现性好、操作简单、结果直观、适合现场检测等诸多优点，但非常依赖于抗体的好坏；且由于抗原表面决定簇类似，常使结果发生交叉反应；3）分子生物学检测技术操作步骤简单、快速、高效，但仪器设备昂贵，无法区分活、死致病菌，易造成假阴性结果；4）质谱鉴定技术能够快速、有效对致病菌进行鉴定，但也存在一定的局限性，对微生物图谱数据库依赖度高，需要不断完善和更新微生物图谱数据库。

随着我国社会经济的发展和科学技术的更新，乳制品食源性致病菌快速检测技术还有很大的发展空间。研究人员应加强对以下方面更为深入的探索：1）加强相关检测技术和设备的研究，与时俱进，积极创新多元化、智能化、便携化和节约化检测技术及检测设备，实现生产过程实时在线监测和现场快速检测，大大提高食源性致病菌检测效率，从而全面提升乳制品安全检测与质量检测水平，有效控制食物中毒事件的发生，切实为人民群众生命健康提供有力保障；2）在新型科学技术不断涌现的当下，还应积极探索与元宇宙、人工智能、大数据、区块链等新型创新技术的联用，为乳制品行业风险监控提供强有力的技术支持。