反相高效液相色谱法测定发酵乳中赤藓红含量

陈 静，段国霞，刘丽君，李翠枝*，吕志勇

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

赤藓红，又名樱桃红，是一种人工合成着色剂，由荧光素碘化而成，其性质稳定、色彩鲜艳、成本低廉。目前，赤藓红的应用很广泛[1-4]，其作为常见的人工食品添加剂已成为人们日常消耗品的一部分[5]，可单独使用或与其他食用色素复配使用，经常添加于食品、药品、化妆品中，也可以作为反应剂[6]等应用于各类研究中。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[7]对其使用量有严格规定，并建立了相应的国标方法[8]进行检测，但对于赤藓红的检测方法为液-液萃取法，操作方法复杂，且方法适用基质有限。根据现有文献报道，赤藓红应用的基质很广，食品类包括：蛋糕[9]、酒类[10]、饮料[11-12]、冷冻饮品[13]、肉制品[14]、罐头[15]、糯米类[16-17]、蜜饯[18]、辣椒粉[19]等；药品包括：中药类[20-21]、西药类[22]、药品包装[23-24]等；其他类包括：烟草类[25-27]等。其检测方法也有很多，如高效液相色谱法[28]、超高效液相色谱法[29]、高效液相色谱-质谱联用法[30-31]、共振瑞利散射法等其他方法[32-33]。但对发酵乳中赤藓红的测定还少有报道。发酵乳中一般不添加赤藓红，对于含有果酱、果泥、果粒等的果品发酵乳会有一定的带入风险，对产品质量控制和风险控制产生潜在风险。

本研究拟建立发酵乳中赤藓红的反相高效液相色谱检测方法。采用酶法水解蛋白，无水乙醇提取，碱性条件下固相萃取小柱净化富集，经反相C18柱分离，紫外可见检测器检测，保留时间定性，外标法定量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳 市售。

甲醇（色谱纯）（诺尔施） 成都市科隆化学品有限公司；无水乙醇（色谱纯） 福晨（天津）化学试剂有限公司；氨水（优级纯） 天津市富宇精细化工有限公司；乙酸铵（优级纯） 天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠（分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水；赤藓红标准品（纯度85.7%） 德国Dr.Ehrensorfer公司；木瓜蛋白酶（酶活力2 000 U/mg） 上海泰坦科技股份有限公司；HLB固相萃取小柱（3 cc，60 mg） 美国Waters公司。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪（配备紫外检测器） 美国安捷伦公司；AL204分析天平、PE20K pH计 瑞士Mettler-Toledo公司；SHA-B水浴恒温振荡器 常州市凯航仪器有限公司；KQ-600DB数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；3K30高速离心机 德国Sigma公司；TurboVap LV氮气浓缩装置 美国Biotage公司；0.45 μm微孔过滤器 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 流动相溶液配制

乙酸铵溶液（20 mmol/L，pH 6.5）：称取1.542 g乙酸铵于800 mL超纯水中，用冰乙酸调节pH值至6.5，用超纯水定容至1 000 mL。

体积分数5%氨化甲醇溶液：量取甲醇95 mL、氨水5 mL混匀。

氢氧化钠溶液（20 g/L）：称取2 g氢氧化钠，加水至100 mL，溶解混匀。

1.3.2 标准溶液配制及标准曲线的绘制

赤藓红标准储备液（1.00 mg/mL）：准确称取按其纯度折算为100%质量的赤藓红标准品0.100 g，置于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

赤藓红标准中间液（100 μg/mL）：准确移取赤藓红标准储备液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

赤藓红标准工作液：上述混合中间液用水分别稀释成质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的工作液。现用现配。

标准曲线制作：将混合标准工作液进行色谱测定，记录各组分的色谱峰面积，以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。

1.3.3 样品处理

准确称取试样1.0 g（精确至0.000 1 g）于10 mL容量瓶，加入0.04 U木瓜蛋白酶，加水至约3 mL，60 ℃水浴30 min[34]。酶解后的试样自然冷却至室温，使用无水乙醇定容至10 mL，振荡摇匀，超声30 min，于4 ℃、8 000 r/min离心5 min。取上清液5 mL，使用20 g/L氢氧化钠溶液调节pH 7.5～7.7。上述前处理溶液加入活化好的HLB小柱（分别使用5 mL甲醇、5 mL水活化），速率为1 滴/s，待液体全部留出，用水洗涤，然后用6 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于氮吹浓缩仪上60 ℃吹干，加入1.0 mL水溶解，摇匀后上机。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：月旭-AQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：20 mmol/L乙酸铵缓冲盐（pH 6.5）-甲醇体系，梯度洗脱程序如表1所示；检测器波长520 nm；进样量30 μL；柱温40 ℃；流速1 mL/min。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.5 结果计算

将试样溶液进行色谱测定，记录各组分的色谱峰面积。按照下式计算样品中赤藓红的含量。

式中：X为样品中赤藓红含量/（mg/kg）；ρ为由标准曲线计算得出的试样中赤藓红质量浓度/（μg/mL）；V为定容体积/mL；n为稀释倍数；m为样品质量/g。

1.3.6 回收率和精密度测定

回收率测定：在空白发酵乳中分别添加不同量的赤藓红，进行加标回收实验，分别平行测定6 次，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

精密度测定：对发酵乳加标样品分别进行6 次重复测定，并计算RSD。

1.4 数据处理

使用Excel软件进行处理及分析。

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

2.1.1 加酶量的选择

一般合成着色剂与蛋白质的相互作用力通常被认为是非共价键作用，包括氢键、范德华力、疏水及静电作用等[35]，使用木瓜蛋白酶对蛋白质进行酶解，生成小分子的肽[36-37]，破坏了蛋白质的结构，减少了非共价键作用，从而可以使合成着色剂更易使用无水乙醇提取。发酵乳的pH值一般为4.6～5.2，均为酸性，蛋白质处于紧密结合的状态，使用单一有机溶剂不能完全提取发酵乳中的赤藓红，需要分解蛋白质后再进行提取。

分解样品中蛋白质所需木瓜蛋白酶量与样品蛋白质含量相关，即与样品称样量相关。确定样品称样量为1 g，使用赤藓红添加量为1.0 mg/kg的发酵乳试样进行不同加酶量实验。由图1可知，当样品称样量为1 g，加酶量大于0.03 U时，赤藓红回收率均大于90%，而加酶量为0.04 U时回收率大于95%。使用Minitab软件对赤藓红回收率结果进行单因子方差分析，表明在95%置信度下，不同加酶量的回收率有显著差异。考率到酶成本和高回收率原则等因素，确定加酶量为0.04 U作为后续实验最佳条件。

图1 不同加酶量与赤藓红回收率结果箱线图（nn==33）Fig.1 Effect of papain dosage on the recovery of erythrosine (n = 3)

2.1.2 提取溶剂的选择

一般合成着色剂的提取溶剂有氨水-无水乙醇体系等有机溶剂和水相溶剂。因氨水具有高挥发性和强刺激性，对人体有一定的危害。分别采用无水乙醇、甲醇、水作为提取溶剂，对赤藓红添加量为1.0 mg/kg的发酵乳试样进行实验，平行测定3 次。由图2可知，在95%置信度下，不同提取溶剂的回收率结果有显著差异。使用水作为提取溶剂，因受发酵乳溶液pH值的影响，赤藓红与蛋白质的结合比较紧密，其提取回收率较低；使用有机溶剂提取时，同样条件下无水乙醇的提取回收率比甲醇高。综上所述，选择无水乙醇作为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂与赤藓红回收率结果箱线图（nn==33）Fig.2 Effect of extraction solvents on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.1.3 提取溶剂添加量的选择

提取溶剂的提取能力是影响回收率结果的关键，一般情况下，有机溶剂与水相的比例会影响目标物的提取，即酶解水相与提取溶剂体积比会影响回收率。对赤藓红添加量为1.0 mg/kg的发酵乳试样，采用酶解水相与无水乙醇体积比分别为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4进行实验。由图3可知，在95%置信度下，不同体积比对回收率结果有显著影响。体积比2∶8、3∶7、4∶6的回收率均在90%以上，符合GB/T 27404《实验室质量控制规范 食品理化检测》关于回收率的要求。实验使用体积比4∶6提取，样液离心后，溶液仍不澄清，不利于过柱；体积比2∶8和3∶7条件下回收率较高，均大于95%。在95%置信度下，体积比2∶8和3∶7对回收率结果无显著影响，但体积比2∶8条件下操作时，2 mL的水不易完全溶解样品，尤其是黏稠的发酵乳样品，影响样品酶解及测定值的准确性，故确定酶解水相与无水乙醇体积比3∶7作为提取溶剂的最佳比例。

图3 不同酶解水相与无水乙醇体积比与赤藓红回收率结果箱线图（nn==33）Fig.3 Effect of volume ratio between enzymatic hydrolysate and anhydrous ethanol on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.1.4 超声时间的选择

分别使用超声时间10、20、30、40 min进行实验。由图4可知，在95%置信度下，不同的超声时间对回收率结果有影响。超声时间10、20、30、40 min条件下的回收率均在90%以上，符合GB/T 27404关于回收率的要求。而超声时间30、40 min的回收率均大于95%，考虑到高回收率和时间节约原则，选择超声时间为30 min。

图4 不同超声时间与赤藓红回收率结果箱线图（nn==33）Fig.4 Effect of ultrasonic time on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.2 过柱条件的选择

目前文献方法中使用的固相萃取小柱有聚酰胺小柱、HLB小柱等。聚酰胺小柱的一般上柱方式是酸性上柱、淋洗，碱性洗脱，赤藓红色素耐酸碱性较差，故本研究选择HLB固相萃取小柱进行净化富集，并对样液过柱pH值进行研究。分别调节样液pH值为4.6、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5进行实验。由图5可知，pH值7.5时的回收率大于90%，且回收率稳定，在95%置信度下，不同的过柱pH值对回收率结果有显著影响。需要进一步选择pH值范围，细化pH值为7.4、7.5、7.6、7.7、7.8，由图6可知，pH值7.4～7.7时的回收率均大于90%且稳定，符合GB/T 27404关于回收率的要求，在95%置信度下，不同的过柱pH值对回收率有显著影响，pH值为7.4和7.8时的回收率均小于95%，pH值为7.5、7.6、7.7时回收率均大于95%。由图7可知，进一步分析发现，pH值为7.5～7.7条件下，在95%置信度下，不同的过柱pH值对回收率无显著影响。考虑高回收率原则，选择过柱pH值为7.5～7.7。

图5 不同上柱pH值（4.6、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）与赤藓红回收率结果箱线图（nn==33）Fig.5 Effect of sample pH (4.6, 5.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, and 8.5) on the recovery of erythrosine (nn = 3)

图6 不同上柱pH值（7.4、7.5、7.6、7.7、7.8）与赤藓红回收率结果箱线图（nn==33）Fig.6 Effect of sample pH (7.4, 7.5, 7.6, 7.7 and 7.8) on the recovery of erythrosine (nn = 3)

图7 不同上柱pH值（7.5、7.6、7.7）与赤藓红回收率结果箱线图（nn==33）Fig.7 Effect of sample pH (7.5, 7.6 and 7.7) on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.3 方法学考察

2.3.1 线性方程与相关系数

将不同质量浓度的赤藓红系列标准工作液在不同时间、上述洗脱条件下经高效液相色谱仪测定，并计算线性回归方程。由表2可知，配制3 d的标准工作液得到的标准工作曲线的相关系数均大于0.999，表明目标物的线性关系良好。

表2 赤藓红的线性回归方程及相关系数Table 2 Linear regression equations and correlation coefficients for erythrosine standard solution stored for different time periods

2.3.2 定量限与检出限

对赤藓红添加量为2 mg/kg的发酵乳试样进行测定，由图8可知，色谱图杂质峰干扰小，分离度为2.56，符合《中国药典》中关于分离度≥1.5的要求。

图8 发酵乳加标样品反相高效液相色谱图Fig.8 Reversed-phase high performance liquid chromatogram of spiked fermented milk

由表3可知，按照信噪比（RS/N）均满足≥3的要求，赤藓红的检出限为0.1 mg/kg，按照RS/N均满足≥10的要求，赤藓红的定量限为0.2 mg/kg。

表3 赤藓红的检出限与定量限Table 3 LODs and LOQs of erythrosine

2.3.3 方法的回收率与精密度

测定发酵乳中添加定量限、2 倍定量限和10 倍定量限3 个不同添加量赤藓红的加标回收率。由表4可知，赤藓红的加标回收率为93.1%～105.6%，RSD为1.87%～2.21%，说明该方法测定发酵乳中赤藓红具有很好的准确度和精密度。

表4 赤藓红的加标回收率及精密度测定结果（nn==66）Table 4 Recoveries and precision (RSD) of erythrosine in spiked fermented milk (nn = 6)

2.4 实际样品测定

根据本研究方法对市售7 款含果品发酵乳进行测定，由表5可知，目前市售添加果泥、果粒等原料的发酵乳未检出赤藓红。

表5 样品中赤藓红测定结果Table 5 Results of erythrosine detection in real samples

3 结 论

采用反相高效液相色谱法对发酵乳中赤藓红的含量进行测定时，样品采用酶法水解蛋白、无水乙醇提取，碱性过柱净化，采用C18色谱柱分离，应用甲醇-乙酸铵缓冲溶液作为流动相进行梯度洗脱。结果表明，本方法准确度满足定量要求，方法精密度良好，回收率高，操作简便，适用于发酵乳中赤藓红含量的测定，可为发酵乳中赤藓红的检测及风险监控提供技术支持。