基于实验数据分析水杨酸苯酚贴膏现行质量标准

刘晓强 蒋晓勤 潘璐艳

水杨酸苯酚贴膏又名鸡眼膏，是治疗鸡眼的常用药，其处方由水杨酸780 g、苯酚40 g及基质适量制成1 000 g。其中水杨酸起抗真菌、止痒及溶解角质作用，苯酚则为消毒防腐剂，起杀菌、止痒作用，常见不良反应为皮肤刺激和腐蚀[1-2]。现行质量标准《国家药品标准》（地方标准上升为国家标准）第十一册WS-10001-（HD-0927）-2002，检验项目包括性状、鉴别（酚羟基化学反应鉴别）、检查（5片重）及含量测定（容量分析法测定水杨酸含量），而该片芯呈淡红色至砖红色，其含量测定项下供试品溶液呈淡红色至红色，而容量分析法以0.1 mol/L NaOH为滴定剂，酚酞为指示剂，滴定终点颜色变化为无色至粉红色，滴定终点的判定明显受到溶液颜色的影响。同时，因不同厂家供试品溶液颜色有差异，滴定终点受到影响也有差异，导致该含量分析方法准确性也有差异。此外，该标准中未涉及该复方制剂中有效成分之一苯酚的鉴别及含量测定，导致无法判定其成品制剂中是否含有苯酚及含量。笔者拟采用自建高效液相色谱法（HPLC）对水杨酸苯酚贴膏中水杨酸及苯酚含量进行检测，并将实验结果简要汇报如下。

1 仪器、试剂与方法

1.1 仪器

岛津LC-20AD高效液相色谱仪（含四元低压泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器、色谱工作站，日本岛津公司），岛津LC-40D X3高效液相色谱仪（含四元高压泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、色谱工作站，日本岛津公司），赛默飞 UltiMate3000高效液相色谱仪（含三元低压泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器、色谱工作站，美国赛默飞世尔科技公司），梅特勒XP205电子天平（瑞士Mettler Toledo），Milli-Q纯水机（美国Merck）。

1.2 试剂与药品

冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司，20220610），纯化水（实验室自制），苯酚（中国食品药品检定研究院，100509-202005，100%），水杨酸（中国食品药品检定研究院，100106-202106，99.8%），4-羟基间苯二甲酸（中国食品药品检定研究院，101150-201602），4-羟基苯甲酸（中国食品药品检定研究院，101149-202204），1,4-对苯醌（中国食品药品检定研究院，101197-201904）。水杨酸苯酚贴膏，生产企业A（12批次），生产企业B（21批次），生产企业C（7批次），生产企业D（7批次），生产企业E（7批次），生产企业F（3批次）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件[3-5]色谱柱：C18（Shim-Nex CS C18，4.6×150 mm，5 μm），流动相：甲醇-2%冰醋酸溶液（40∶60），柱温：35 ℃，波长：270 nm，流速：1.0 ml/min，进样量：10 μl。

1.3.2 溶液制备方法系统适用性溶液的制备：取4-羟基苯甲酸、4-羟基苯二甲酸、1,4-对苯醌、水杨酸、苯酚各适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释成每毫升中分别约含4-羟基苯甲酸5 μg、4-羟基苯二甲酸2.5 μg、1,4-对苯醌5 μg、水杨酸5 mg与苯酚0.25 mg的混合溶液。

供试品溶液的制备：取本品20片，研细混匀，精密称取2片量，置100 ml量瓶中，加乙醇适量，超声使水杨酸及苯酚溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀即得（苯酚供试品溶液）。精密量取上述溶液5 ml，置50 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀即得（水杨酸供试品溶液）。

对照品溶液的制备：取水杨酸及苯酚各适量，精密称定，加乙醇溶解并稀释成每毫升中约含水杨酸0.312 mg、苯酚0.16 mg的溶液。

1.3.3 含量计算方法按外标法以峰面积计算供试品中的水杨酸及苯酚含量，按标示量计算。

1.3.4 方法学验证内容依据《中华人民共和国药典》2020年版四部9101分析方法验证指导原则项下要求，结合本方法应用范围（拟用于高效液相色谱鉴别、有关物质检查以及含量测定等），笔者拟进行专属性、精密度（对照品进样精密度、重复性、中间精密度）、准确度、范围及线性、耐用性（包括流速、流动相比例、柱温、仪器以及色谱柱等）等方法学考察项目[6-8]。

2 结果

2.1 方法学验证结果

专属性实验结果表明溶剂乙醇、空白基质均未在苯酚峰及水杨酸峰处出峰，不干扰检测；系统适用性溶液中1,4-对苯醌、4-羟基苯甲酸、苯酚、4-羟基间苯二甲酸以及水杨酸等各成分色谱峰依次出峰，峰形良好，且各峰间分离度符合规定。见图1。苯酚供试品溶液、水杨酸供试品溶液中苯酚及水杨酸色谱峰保留时间、紫外吸收峰与对照品溶液一致。

精密度实验结果如下：对照品进样精密度实验中苯酚和水杨酸峰面积的相对标准偏差（RSD）依次为0.03%和0.03%，重复性实验中6份供试品苯酚和水杨酸含量的RSD依次为0.8%和0.4%，中间精密度实验中6份供试品苯酚和水杨酸含量的RSD依次为1.7%和0.8%。准确度实验中苯酚和水杨酸低、中、高浓度加样回收率为99.5%～100.6%及99.9%～100.8%.

范围及线性实验结果表明苯酚在0.08～0.24 mg/ml范围内，r=0.999 97，表明线性良好，水杨酸在0.156～0.468 mg/ml范围内，r=0.999 93，表明线性良好。耐用性实验中，流速依次调整为0.8 ml/min及1.2 ml/min，流动相依次调整为甲醇-2%冰醋酸溶液（35∶65）及甲醇-2%冰醋酸溶液（45∶55），柱温依次调整为30 ℃及40 ℃，高效液相色谱仪依次更换为岛津LC-40D X3及赛默飞 UltiMate3000，依次采用Shim-pack VP-ODS C18（4.6×250 mm，5 μm）及XBridge C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱时，系统适用性溶液中各色谱峰峰间分离度均满足要求，对照品进样精密度符合要求。

综上所述，该方法专属性、精密度（对照品进样精密度、重复性、中间精密度）、准确度、范围及线性等方法学考察项目均符合规定。

2.2 含量测定结果

从图2中可以看出6家生产企业的水杨酸苯酚贴膏中水杨酸含量（按标示量计）均高于100%，在101%～109%之间，均落在限度（90%～110%）范围内。苯酚含量（按标示量计）均低于10%，其中A、D、E、F 4家低于1%，均不在限度（90%～110%）范围内。见图3。

图2 水杨酸含量测定结果

图3 苯酚含量测定结果

3 讨论

3.1 自拟方法

笔者基于对水杨酸苯酚贴膏质量再评价的初衷建立并验证了水杨酸苯酚贴膏中水杨酸及苯酚的HPLC含量测定方法。笔者选择以乙醇而非流动相为溶解溶剂是出于水杨酸和苯酚的溶解度原因，查询《中华人民共和国药典》2020年版二部水杨酸及苯酚各论项下，水杨酸在乙醇或乙醚中易溶，在沸水中溶解，在三氯甲烷中略溶，在水中微溶；苯酚在乙醇、三氯甲烷、乙醚、甘油、脂肪油或挥发油中易溶，在水中溶解，在液状石蜡中略溶。水杨酸及苯酚在甲醇中溶解度均未知，且水杨酸苯酚贴膏现行质量标准中含量测定项下所用的溶解溶剂为中性稀乙醇，基于上述几点因素，笔者最终选用乙醇为溶解溶剂。该方法验证过程参考了《中华人民共和国药典》2020年版四部9101分析方法验证指导原则项下要求，因该方法主要用于含量测定，因此主要按含量测定项下要求进行，依次验证了专属性、精密度（对照品进样精密度、重复性、中间精密度）、准确度、范围及线性、耐用性等，所有验证项目均符合规定。同时，需指出，该方法也可用于该品种两种主成分水杨酸及苯酚的高效液相色谱鉴别和有关物质检查。

3.2 原因分析

本制剂为复方制剂，此次涉及的所有生产企业的水杨酸苯酚贴膏中有效成分水杨酸含量符合规定而苯酚含量均不符合规定，基本可以排除投料原因。而苯酚属于挥发性酚类物质，其在室温下即可挥发。因此，笔者考虑导致所有涉及批次苯酚含量均不合格的原因可能为处方及制剂工艺。笔者查询了上述6家生产企业的水杨酸苯酚贴膏说明书，将处方简要罗列如下：生产企业A，水杨酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、石蜡、色素；生产企业B，水杨酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、色素；生产企业C，水杨酸、苯酚、凡士林、石蜡、乙醇、色素；生产企业D，水杨酸、苯酚、凡士林、石蜡、乙醇、色素；生产企业E，水杨酸、苯酚、凡士林、石蜡、色素；生产企业F，水杨酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、石蜡、色素；色素包括碱性玫瑰红、胭脂红等。上述基质中凡士林、羊毛脂在室温下呈半固态，石蜡呈固态。基于上述几种物质的特性，生产企业在工艺投料环节可采用加热的工艺将上述物质熔化以保证原辅料混合均匀。而苯酚属于挥发性酚类物质，在室温下即可挥发，加热则会加剧苯酚挥发，进一步降低产品中苯酚含量。此外，市售产品中，部分厂家并未对该产品加用药品包装用复合膜袋，可导致产品中的苯酚在运输、储藏过程中进一步挥发，导致最终测得产品中苯酚含量极低。

3.3 思考与建议

基于上述实验数据可知，虽上述批次水杨酸苯酚贴膏按现行质量标准检验均合格，但实际其已基本不含有效成分之一苯酚，因此按现行质量标准无法有效控制该产品质量[9]。因此基于严控已上市药物质量的角度出发，建议修订现行质量标准，具体建议如下：1）增订高效液相色谱鉴别项，规定供试品溶液中苯酚与水杨酸峰的保留时间应与对照品溶液中相应主峰的保留时间一致。2）增加微生物限度检查项，规定取本品100 cm2，按《中华人民共和国药典》2020年版检查，需氧菌总数不得超过102cfu/10 cm2，霉菌和酵母菌总数不得超过10 cfu/10 cm2，每10 cm2不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。3）修订含量测定方法，将水杨酸含量测定方法由容量分析法改为HPLC，同时增加苯酚含量测定项（HPLC），并规定按标示量计，苯酚和水杨酸含量均应为90.0%～110.0%。

此外，笔者建议各生产企业进一步优化处方，上述处方分析中，多家企业处方中含有石蜡，石蜡在室温下呈固态，虽有助于该制剂成品中片芯保持良好的性状，但其溶解温度较高，可能会导致原辅料混合阶段苯酚大量挥发，建议少用或不用。有生产企业处方中含有乙醇，该辅料有助于将固态的水杨酸、苯酚及色素原料转化为水杨酸、苯酚及色素溶液，减少原辅料混合阶段加温的温度与时长，可有效避免苯酚的挥发，建议其他生产企业参考或使用。同时建议各生产企业改进生产工艺，尽可能采用低温搅拌工艺或物理搅拌工艺，尽可能降低制剂工艺中苯酚的挥发量。此外，为减少储存、运输过程中苯酚挥发量，建议在水杨酸苯酚贴膏外加药品包装用复合膜袋，同时在包装盒外加用塑料复合膜。

综上所述，本文所建立的水杨酸苯酚贴膏中水杨酸及苯酚的HPLC测定方法可用于水杨酸苯酚贴膏中水杨酸及苯酚的高效液相色谱鉴别、含量测定，上述HPLC也可进一步用于该制剂的有关物质检查。同时，基于采用上述方法测定的含量结果，现行质量标准已无法有效控制该产品质量，建议更新标准。此外，建议各水杨酸苯酚贴膏生产企业致力于水杨酸苯酚贴膏的处方、制剂工艺以及包装研究，以提高市场流通环节中水杨酸苯酚贴膏中苯酚含量，保障广大患者用药安全。