基于IL-6/STAT3通路探讨血塞通对血栓闭塞性脉管炎大鼠的保护作用

杜建青 汪立 吴忠隐 张弘 (承德医学院附属医院血管外科，河北 承德 067000)

血栓闭塞性脉管炎(TAO)是一种炎症性血管疾病，主要影响四肢中的中小型血管，其主要病理生理改变为周围血管炎症和闭塞，临床轻症表现为四肢受损，重症可出现肢体溃疡，迫使患者截肢，但其传统治疗效果并不理想〔1〕。血塞通主要成分是五加科人参属植物三七提取物，用于心脑血管疾病的治疗，具有抑制血小板凝聚、降低血液黏稠度、抑制血栓形成的作用，联合低分子肝素能明显改善大隐静脉曲张高位结扎剥脱术患者术后血液高凝状态，有效减少深静脉血栓形成〔2〕，还可通过下调信号转导及转录激活因子(STAT)3信号通路，抑制缺血性脑卒中大鼠神经元细胞凋亡〔3〕。STAT3信号通路可参与细胞增殖、分化、免疫调节等多种重要的生物学进程，白细胞介素(IL)-6为其上游因子，而IL-6表达的增加可进一步激活Janus激酶(JAK)2/STAT3信号通路〔4〕。另外，抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)活性，可降低血管炎大鼠人脐静脉内皮细胞和血管组织中炎性因子的表达，减轻大鼠肢体损伤〔5〕。但血塞通是否调控IL-6/STAT3通路对TAO大鼠起保护作用，目前尚未有报道。本研究采用月桂酸钠注射法构建TAO大鼠模型，使用血塞通和STAT3激活剂Colivelin干预该模型，旨在从IL-6/STAT3通路揭示血塞通对TAO大鼠的保护作用，为血塞通在临床上对TAO的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠(75只，雄性，体重200～220 g)购自重庆医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK(渝)2018-0003，符合国家实验室动物伦理保护标准及相关法律规定。按照3R原则给予实验动物人道的关怀照顾。

1.1.2实验药物 血塞通(批准文号：国药准字Z53021486)购自云南维和药业股份有限公司；Colivelin(STAT3激活剂，在体外和体内增加STAT3的磷酸化，规格：1 mg，产品编号：sc-361153)，购自MCE公司。

1.1.3主要试剂和仪器 大鼠血栓形成素(TX)B2、6-酮-前列腺素(6-Keto-PG)F1α、纤维蛋白原(Fg)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET)-1和血管内皮生长因子(VEGF) ，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、β-actin鼠抗均购自美国Sigma公司；蛋白提取试剂盒、电化学发光(ECL)显色试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、JAK2、STAT3和磷酸化(p)-STAT3鼠抗、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗均购自美国Abcam公司；酶标仪Fax-20100购自美国INStat公司；尼康SMZ745光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司；全能型凝胶成像分析系统ChemiDoc-MP购自山东三瑞科技有限公司。

1.2方法

1.2.1TAO大鼠模型的建立及分组 采用月桂酸钠注射法〔6〕构建TAO大鼠模型：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，仰卧位固定于手术台上，剔除左下肢股内侧毛发，2%碘伏消毒皮肤，于腹股沟中点至膝内侧纵行长为1.5～2.0 cm切口，依次分离皮下组织，游离股动脉，使用动脉夹夹闭股动脉近心端，阻断血流，于动脉夹下方远心端注入0.2 ml 10 mg/ml月桂酸钠溶液(假手术组注射0.2 ml生理盐水)，当血管明显充盈，略显白色但无明显肿胀时，轻柔取针。注射15 min后松开动脉夹，检查确保无活动性出血后，即可缝合皮肤，各组大鼠术后均腹腔注射青霉素预防感染。造模完成当日，大鼠患肢足爪处变苍白，甚至青紫，次日患肢足趾变黑，有形成坏疽和木乃伊化的趋势则证明造模成功〔7〕。将造模成功的60只大鼠使用随机数字表法分为模型组、血塞通组(灌胃50 mg/kg〔8〕)、Colivelin组(STAT3激活剂Colivelin〔9〕，1 mg/kg，腹腔注射)、血塞通+Colivelin组(灌胃50 mg/kg血塞通同时腹腔注射1 mg/kg STAT3激活剂Colivelin)，每组15只，另取15只大鼠为假手术组。假手术组和模型组大鼠给予等剂量生理盐水，各组每天给药1次，连续14 d。

1.2.2观察并评价大鼠基本情况和病变程度 末次给药结束后，观察大鼠患肢处皮肤颜色、有无肿胀、坏疽及坏疽程度。根据大鼠患肢情况，将病变程度分为以下级别：0级表现为正常，Ⅰ级表现为仅趾甲部出现病变，Ⅱ级表现为仅趾部出现病变，Ⅲ级表现为足爪部出现病变，Ⅳ级表现为膝关节以下出现病变，Ⅴ级表现为病变发展到膝关节以上，观察统计各组大鼠出现上述不同级别病变的只数。

1.2.3HE染色观察各组大鼠股动脉组织病理学变化 上述1.2.2观察实验结束后，各组大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉实施安乐死，股动脉取血约5 ml，分离血清后置于4℃冰箱中，用于后续ELISA检测。取各组大鼠患肢处注射月桂酸钠以下部位的股动脉组织(包括动脉和静脉主干)，其中5只大鼠该部位组织迅速置于4%多聚甲醛中固定(剩余10只大鼠该部位迅速置于-80℃冰箱，用于后续ELISA，另取所有大鼠患处肌肉组织迅速置于-80℃冰箱，用于后续Western印迹检测)，然后高浓度到低浓度乙醇脱水、二甲苯透明，最后进行石蜡包埋，采用切片机做常规病理切片，按照HE染色试剂盒说明书进行染色后，置于光学显微镜下观察各组股动脉组织病理学变化。

1.2.4ELISA法检测各组血栓形成因子及内皮功能相关因子含量 取出上述1.2.3中置于4℃冰箱的各组大鼠血清及-80℃冰箱中的股动脉组织，分别采用TXB2、6-Keto-PGF1α、Fg、NO、ET-1和VEGF ELISA试剂盒，严格按照说明书操作步骤分别检测各自含量。

1.2.5Western印迹检测各组IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平 取上述1.2.3中置于-80℃冰箱中的各组患侧肌肉组织，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量。取50 g蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、转膜、抗体封闭、1∶1 000浓度稀释后的IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3和p-STAT3鼠抗4℃过夜孵育、置于含辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶2 000)中室温孵育2 h，用ECL显色试剂盒显色，全能型凝胶成像分析系统拍照，以β-actin为内参，分析各组蛋白表达水平。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠基本情况和病变程度比较 假手术组大鼠基本正常，无明显病变，15只均为0级；模型组大鼠患肢足爪或苍白或青紫或暗灰，有跛行或曳行现象，病变程度多处于Ⅳ级(9只)，Ⅴ级2只，Ⅲ级4只。与模型组相比，血塞通组大鼠上述病变明显减轻，病变程度多为Ⅰ级(9只)，0级5只，Ⅱ级1只；Colivelin组上述病变情况明显加重，病变程度多为Ⅴ级(8只)，Ⅳ级5只，Ⅲ级2只。血塞通+Colivelin组大鼠病变程度(Ⅳ级7只，Ⅲ级5只，Ⅱ级2只，Ⅴ级1只)较血塞通组加重，较Colivelin组减轻。

2.2各组股动脉组织病理学变化比较 假手术组股动脉组织血管形态完整，无明显病理现象；模型组股动脉组织血管有大量血栓形成，内皮细胞脱落严重。与模型组相比，血塞通组股动脉组织血管及内皮细胞病理现象明显减轻；Colivelin组股动脉组织血管及内皮细胞病理现象明显加重。血塞通+Colivelin组股动脉组织病理现象较血塞通组加重，较Colivelin组减轻。见图1。

图1 各组股动脉组织病理变化(HE染色，×100)

2.3各组血清中血栓形成因子含量比较 与假手术组相比，模型组血清中TXB2和Fg含量显著升高，6-Keto-PGF1α含量显著降低(P<0.05)；与模型组相比，血塞通组血清中TXB2和Fg含量显著降低，6-Keto-PGF1α含量显著升高(P<0.05)；与血塞通组相比，血塞通+Colivelin组血清中TXB2和Fg含量显著升高，6-Keto-PGF1α含量显著降低(P<0.05)；与Colivelin组相比，血塞通+Colivelin组大鼠血清中TXB2和Fg含量显著降低，6-Keto-PGF1α含量显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清中血栓形成因子含量、IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表达水平及STAT3磷酸化水平比较

2.4各组股动脉组织中内皮功能相关因子含量比较 与假手术组相比，模型组股动脉组织中NO含量显著降低，ET-1和VEGF含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，血塞通组股动脉组织内中NO含量显著升高，ET-1和VEGF含量显著降低(P<0.05)；Colivelin组股动脉组织中NO含量显著降低，ET-1和VEGF含量显著升高(P<0.05)。与血塞通组相比，血塞通+Colivelin组股动脉组织中NO含量显著降低，ET-1和VEGF含量显著升高(P<0.05)；与Colivelin组相比，血塞通+Colivelin组股动脉组织中NO含量显著升高，ET-1和VEGF含量显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组内皮功能相关因子含量比较

2.5各组患侧肌肉中IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表达水平及STAT3磷酸化水平比较 与假手术组相比，模型组IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表达及STAT3磷酸化水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，血塞通组IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表达及STAT3磷酸化水平显著降低(P<0.05)，Colivelin组IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表达及STAT3磷酸化水平显著升高(P<0.05)。与血塞通组相比，血塞通+Colivelin组IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表达及STAT3磷酸化水平显著升高(P<0.05)。与Colivelin组相比，血塞通+Colivelin组IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表达及STAT3磷酸化水平显著降低(P<0.05)。见表1和图2。

1～5：假手术组、模型组、血塞通组、Colirelin组、血塞通+Colivelin组图2 各组IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3、p-STAT3水平表达

3 讨 论

TAO是一种影响四肢小血管的非动脉粥样硬化炎症性疾病，病变主要累及四肢及远端中小动静脉，病理表现为出现大量浸润性血栓、炎症反应及内皮功能障碍，临床表现为患肢缺血、疼痛、发凉，麻木等〔10〕。

随着对中医药的不断研究，人们发现以三七皂苷为主要成分的血塞通具有活血祛瘀，通脉活络，增加脑血流量的作用。Zhao等〔11〕研究发现血塞通注射液可用于治疗心脑血管疾病，具有保护心血管，减轻心肌缺血/再灌注损伤的作用。在常规治疗的基础上加用注射用血塞通可减少大脑中动脉粥样硬化性引起的微血栓，可降低缺血性事件发生率，且未产生不良反应的发生〔12〕。而塞通分散片已被临床证实是治疗心脑血管疾病的有效药物〔13〕。多种炎症性血瘀患者体内Fg、TXB2和ET-1含量显著增加，6-Keto-PGF1α表达量显著降低〔14，15〕，抑制ET水平，提高NO水平，可缓解血管内皮细胞功能障碍〔16〕。Zhang等〔17〕研究发现降低股动脉中TXB2、ET-1和TNF-α表达，增加6-Keto-PGF1α的表达，可改善TAO大鼠股动脉病理特征。提示血塞通可缓解TAO大鼠内皮血管功能障碍，对TAO大鼠起保护作用，但其中的机制尚需进一步研究。

STAT3为一类由750～800个氨基酸组成的DNA结合蛋白，可介导细胞的恶性转化，参与肿瘤的增殖、分化、血管生成、侵袭转移和免疫逃避等生理功能的调控。Liu等〔18〕研究发现激活IL-6/JAK2/STAT3通路可诱发小鼠浆细胞乳腺炎，Wei等〔19〕研究发现IL-6/STAT3通路的激活可通过引起血管内皮细胞功能障碍参与TAO的发病机制，而抑制IL-6/STAT3信号通路可减轻炎症损伤〔20〕。本研究提示，血塞通可能通过抑制IL-6/STAT3通路，对TAO大鼠起保护作用。本研究提示，血塞通对TAO大鼠的保护作用可被STAT3激活剂Colivelin逆转，进一步揭示血塞通可能通过抑制IL-6/STAT3通路，保护TAO大鼠。

综上所述，血塞通可通过抑制IL-6/STAT3通路，缓解TAO大鼠血管内皮功能障碍，减轻炎症反应，对TAO大鼠起保护作用。然而TAO病理过程可能涉及其他机制，因此血塞通的具体作用机制仍有待进一步完善。