梅花鹿鹿茸总蛋白对糖尿病肾病大鼠肾损伤的治疗作用及分子机制

崔 艳，赵晓露，师晶晶，刘 云

(新乡医学院第一附属医院肾脏病医院，河南 卫辉 453100)

我国糖尿病患者众多，成人中糖尿病患病率超过10%；糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的并发症之一，2020年中华医学会糖尿病分会调查显示，我国20%～40%的糖尿病患者合并DN[1]。DN现已成为慢性肾脏病的主要原因，并与心血管疾病的发病率和病死率显著增加相关；因此，延缓DN进展尤为重要。研究表明，DN的发生和发展与氧化应激、糖脂代谢紊乱、晚期糖基化终产物沉积以及肾脏血流动力学改变等多种因素相关[2-3]。研究报道，梅花鹿鹿茸总蛋白(Sika deer velvet antler protein，SVPr)能够抑制细胞无序供能，延缓肾脏活性氧(reactive oxygen species，ROS)氧化应激损伤进程，从而减轻庆大霉素诱导的急性肾损伤[4-5]。核转录因子 E2 相关因子-2(nuclear factor erythroid-2 related factor-2，Nrf-2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路是一条经典的抗氧化通路，其与DN的发展尤为相关[6]。沉默调节蛋白1(sirtuin1，SIRT1) 是一类组蛋白去乙酰化酶，可通过调节氧化应激、肾小管间质纤维化、自噬、细胞凋亡和炎症等各种内源性途径参与DN的发生发展，发挥肾脏保护作用。本研究拟从Nrf-2/HO-1、SIRT1的角度探讨SVPr在DN大鼠肾脏高糖代谢、ROS氧化应激、肾脏纤维化损伤中的作用，以期为临床DN的治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级2～4周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠购自郑州大学药物研究院，动物生产许可证号：SYXK(豫)2018-0004，体质量83.15～99.14 g,于温度(22±2)℃、相对湿度(65±5)%、光照周期12 h/12 h条件下适应性饲养7 d。

1.2 药物、主要试剂和仪器梅花鹿鹿茸粉购自上海雅吉生物科技有限公司；二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司(国药准字H20023371)，链脲佐菌素(streptozocin，STZ)购自伊塔生物科技有限公司，血糖仪及试纸购自美国强生公司，24 h尿蛋白、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血肌酐(serum creatinine，SCr)检测试剂盒购自北京利德曼生物股份有限公司，ROS酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自上海瓦兰生物科技有限公司，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) ELISA试剂盒购自江西艾博因生物科技有限公司，SIRT1、Nrf-2抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司，HO-1抗体购自美国Abbiotec公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自温州科淼有限公司；全自动生物化学分析仪购自美国雅培公司，连续光谱扫描式酶标仪购自日本美谷分子仪器有限公司，Chemi Doc XR型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SVPr制备梅花鹿鹿茸粉碎过120目筛，取鹿茸粉末50.0 g，按液料比13加入蒸馏水，60 ℃、80 Hz条件下超声60 min，过滤，重复3次，合并提取液，凝胶色谱柱测定显示梅花鹿鹿茸总蛋白提取物有效浓度比为0.766 4[7]。

1.3.2 实验分组及DN模型制备将120只SD大鼠按照简单随机数字表法分为对照组、模型组、二甲双胍组、低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组，每组20只。模型组、二甲双胍组、低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组大鼠造模前禁食12 h，单次腹腔注射50 mg·kg-1STZ，7 d后测量大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)≥16.7 mmol·L-1判定为DN模型大鼠造模成功[8]，弃去死亡大鼠(模型组、低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组各1只，二甲双胍组2只)。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。造模成功后，二甲双胍组大鼠给予二甲双胍500 mg·kg-1·d-1灌胃；低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组大鼠分别经尾静脉注射质量浓度为1.47、2.94、4.41 g·L-1的SVPr溶液0.1 mL，每日1次；对照组及模型组大鼠注射等量生理盐水。各组大鼠持续尾静脉注射给药4周。

1.3.3 标本采集给药4周后，将各组大鼠置于代谢笼中，禁食，自由饮水，搜集大鼠24 h总尿量。各组大鼠于空腹状态下采用尾静脉穿刺法采集尾静脉血0.5 mL，4 ℃下4 000 r·min-1离心20 min，取上层血清置于-80 ℃冰箱保存；使用乙醛将各组大鼠麻醉后开腹，完整剥离双侧肾实质组织，将肾实质组织分装保存于-80 ℃液氮冰箱。

1.3.4 大鼠24 h尿蛋白、血糖、BUN和SCr水平检测应用血糖仪测定各组大鼠尾静脉血糖值；取各组大鼠24 h总尿量，应用全自动生物化学分析仪检测24 h尿蛋白量，严格按照试剂盒说明书进行操作；取各组大鼠血清，应用全自动生物化学分析仪检测BUN和SCr水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.5 ELISA法检测各组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平取各组大鼠肾组织，加入磷酸盐缓冲液，用匀浆器将标本匀浆充分，3 000 r·min-1离心20 min，取上清，采用ELISA法检测ROS、NF-κB水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6 Western blot法检测各组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白表达取各组大鼠肾组织，用体积分数25%裂解液于冰上裂解肾组织样本，研磨匀浆，-4 ℃下6 000 r·min-1离心15 min，取上清，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度；取30 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维膜，封闭液封闭2 h，滴加SIRT1、Nrf-2、HO-1、GAPDH一抗，4 ℃下孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)摇动漂洗10 min×3次，置于二抗中室温下孵育2 h，含吐温-20 Tris缓冲液洗膜10 min×3 次，增强电化学发光法显色，应用Chemi Doc XR型凝胶成像仪成像，Image J 软件分析目的蛋白及内参蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 6组大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平比较结果见表1。模型组大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P>0.05)。高剂量SVPr组大鼠SCr、24 h尿蛋白水平显著低于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠BUN、血糖水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。中剂量SVPr组大鼠SCr水平显著低于二甲双胍组，BUN、血糖水平显著高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠24 h尿蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量SVPr组大鼠BUN、24 h尿蛋白、血糖水平显著高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠SCr水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量SVPr组大鼠BUN、血糖、24 h尿蛋白、SCr水平显著低于中剂量SVPr组和低剂量SVPr组，中剂量SVPr组大鼠BUN、血糖、24 h尿蛋白、SCr水平显著低于低剂量SVPr组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 6组大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平比较

2.2 6组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平比较结果见表2。模型组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著低于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。中剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS水平显著高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠肾组织中NF-κB水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB 水平显著高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著低于中剂量SVPr组和低剂量SVPr组，差异有统计学意义(P<0.05)。中剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS水平显著低于低剂量SVPr组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量SVPr组与低剂量SVPr组大鼠肾组织中NF-κB水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 6组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平比较

2.3 6组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量比较结果见图1和表3。模型组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2蛋白相对表达量显著高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠肾组织中HO-1蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。中剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2蛋白相对表达量显著高于二甲双胍组，HO-1蛋白相对表达量显著低于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1蛋白相对表达量显著高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠肾组织中Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量显著高于中剂量SVPr组和低剂量SVPr组，中剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量显著高于低剂量SVPr组，差异有统计学意义(P<0.05)。

1：高剂量SVPr组；2：中剂量SVPr组；3：低剂量SVPr组；4：二甲双胍组；5：模型组；6：对照组。

表3 6组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量比较

3 讨论

随着我国人口老龄化的加速及居民饮食结构和生活方式的显著变化，糖尿病的患病率显著增加。DN是糖尿病主要的微血管并发症，是慢性肾脏病的主要病因，其病理改变复杂，大多呈慢性进行性发展，最终可进展为肾衰竭。DN不仅给患者带来沉重的生活经济负担，还可造成心血管事件和病死率的升高，故DN的治疗具有重大的意义。目前对于DN的治疗主要包括降糖和降压治疗，但即使控制血糖、血压，仍有部分DN患者进展至终末期肾病，因此，探索其他的治疗方法对于改善DN的预后具有重大意义。

SVPr具有清除组织自由基、延缓神经组织纤维化进程、抑制炎症因子及神经保护功能等作用[9]。WANG等[4]研究显示，SVPr可通过增加Nrf-2和HO-1的表达激活Nrf2/HO-1通路，通过降低NF-κB 的蛋白表达抑制 NF-κB 通路，可抑制庆大霉素诱导的小鼠急性肾损伤，提示SVPr具有很强的抗氧化应激、抗炎和抗凋亡作用。另有研究显示，SVPr提取物对顺铂诱发的肾损伤、对乙酰氨基酚诱导的急性肾损伤均有改善作用[10-11]。但SVPr在DN模型中的作用尚未进行验证。本研究结果显示，模型组大鼠血糖、24 h尿蛋白、尿素氮、血肌酐显著高于对照组，各剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠血糖、24 h尿蛋白、BUN、SCr水平低于模型组，而血糖、24 h尿蛋白、BUN、SCr水平随SVPr剂量的增加逐渐降低，这说明，SVPr和二甲双胍均可减轻DN大鼠肾损伤，而SVPr效果更为明显，且呈剂量依赖性。

DN发病机制复杂，与遗传因素、代谢紊乱、氧化应激、炎症反应及细胞因子、自噬等多种因素相关。氧化应激是机体内过多生成的ROS与内源性氧化酶失衡引起的内部反应，这是DN发生的重要机制[12]。肾脏损伤相关的多种因素可激活NF-κB，活化的NF-κB复合物易位至细胞核并结合NF-κB结合基序的DNA进一步转录，导致各种基因异常转录如晚期糖基化终产物积累、氧化应激等。Nrf2/HO-1信号通路是抗氧化应激的经典信号通路，Nrf2是该信号途径中重要的细胞保护性转录因子[13-17]。当机体发生氧化应激时，Nrf2从细胞质中与 Keap1 解离，转移至细胞核中，与抗氧化元件结合，激活下游 HO-1等内源性抗氧化剂的基因表达，以此清除过量的ROS[18]，减轻机体氧化应激损伤程度，因此，阻断ROS及其下游氧化应激、激活HO-1/Nrf-2信号通路是治疗DN的潜在方法之一。本研究结果显示，模型组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著高于对照组，Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量均显著低于对照组；低、中、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著低于模型组，Nrf-2、HO-1蛋白相对表达量显著高于模型组；高剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB 水平显著低于二甲双胍组，Nrf-2蛋白相对表达量显著高于二甲双胍组；中剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、Nrf-2水平显著高于二甲双胍组，HO-1水平显著低于二甲双胍组；低剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著高于二甲双胍组；随SVPr剂量增加，DN大鼠肾组织中ROS、NF-κB 水平逐渐降低，Nrf-2、HO-1水平逐渐增高。这一结果说明，SVPr可能是通过降低ROS和NF-κB水平阻断氧化应激，增加HO-1、Nrf-2水平激活HO-1/Nrf-2 抗氧化应激信号，从而减轻DN大鼠肾损伤。

SIRT1是一种去乙酰化酶，广泛存在于人类组织中，其通过去乙酰化非组蛋白调节糖和脂代谢、应激反应、凋亡、炎症反应和自噬等。研究发现，在糖尿病大鼠肾脏中NF-κB呈过表达，其通过上调SIRT1表达可对NF-κB上的p65亚基去乙酰化,干扰NF-κB信号并抑制其转录活性，下调NF-κB表达，抑制NF-κB介导的炎症信号通路对肾小管上皮的破坏，从而改善肾脏组织炎症反应[19]。有研究显示，SIRT1的异常表达是高糖氧化应激诱导的肾脏不可逆性纤维进程中肾脏代谢紊乱、高自由基超载的关键因素，在DN等疾病转归中发挥着重要作用[6,20-23]。本研究结果显示，模型组大鼠肾组织中SIRT1蛋白相对表达量均显著低于对照组，低、中、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠肾组织中SIRT1蛋白相对表达量显著高于模型组，低、中、高剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1蛋白相对表达量显著高于二甲双胍组，且SIRT1蛋白相对表达量随SVPr剂量的增加显著升高。这一结果证明，SVPr可能通过上调SIRT1表达，抑制NF-κB转录活性，激活HO-1/Nrf-2 抗氧化应激信号，减轻氧化应激，进而减轻DN大鼠肾损伤。

综上所述，与二甲双胍相比较，SVPr能显著减轻DN大鼠肾损伤，其机制可能是通过上调SIRT1蛋白表达来抑制NF-κB转录活性、激活HO-1/Nrf-2抗氧化应激信号，减轻氧化应激，从而减轻肾损伤。