厌氧菌群JAC1降解石油烃能力及其群落结构的解析*

江晓旭 Shahdev Sajnani 傅钰婷 于家率 朱宏飞

(辽宁工程技术大学环境科学与工程学院,辽宁 阜新 123000)

石油事故性泄漏对土壤生态环境造成的严重破坏受到人们广泛关注。多种土壤修复方法中,微生物修复相比物理、化学修复具有无二次污染、发展潜力大的优点。由于地层60 cm以下的土壤氧分压较低,因此在被石油污染的地下深层土壤和蓄水层环境中,石油烃的厌氧降解占据主导地位[1]。近些年来,微生物厌氧降解石油烃被陆续报道。CALLAGHAN等[2]发现硫酸盐还原菌(Desulfosporosinus)对正十六烷有一定厌氧降解能力;LI等[3]从石油污染污泥中筛选分离出的克雷伯氏菌(Klebsiella)对芘表现出较高的厌氧降解能力;硫酸盐还原菌可降解短链或长链碳氢化合物[4]。石油烃厌氧降解不仅为微生物修复石油污染场地提供一个可行的方法,同时也为残余油能源回收提供新思路。

在厌氧或低氧环境中,许多兼性或严格厌氧细菌能够利用有机污染物进行新陈代谢活动,并形成稳定的群落结构[5]。土壤中污染物成分复杂,单一菌株对污染物的降解能力有限。混合细菌体系可通过协同利用污染底物和中间代谢产物等方式对污染物进行降解[6]。有研究表明,通过人为手段筛选并富集培养可高效降解污染物的菌群可使优势功能微生物发生群聚,强化污染物的去除[7]。为此,本研究利用苯酚诱导从石油污染土样中培养富集出石油烃厌氧降解混合菌群(记为JAC1),并用其强化降解去除土壤中的石油烃。通过单因子条件优化实验对JAC1的降解条件进行优化,并对石油烃降解过程进行动力学研究。通过宏基因组学对微生物群落结构进行分析,揭示微生物之间相互作用的规律。研究结果可为无氧环境石油污染修复提供一定理论基础,并为深入研究石油烃厌氧降解代谢奠定基础。

1 实验部分

1.1 土壤样品采集

土壤样品采自阜新市东梁油库(121.554 4°E,41.909 5°N),在0.6～2.0 m深度处平均间隔设置4个采样点,每点取土500 g并混匀,低温隔氧运送回实验室。经检测,土壤样品呈中性(pH=7.19),存在明显的石油污染,总石油烃(TPH)质量浓度高达101.26 mg/kg。

1.2 实验方法

1.2.1 JAC1的培养和筛选

制备改良培养基(Na2SO40.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、K2HPO40.5 g/L、CaCl20.1 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 1.2 g/L、抗坏血酸 0.1 g/L、乳酸钠 4.0 mL/L、酵母膏1.0 g/L、蒸馏水1 L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L),将改良培养基分装到厌氧瓶中,高压蒸汽灭菌20 min。将5 g土壤样品、诱导剂苯酚(200 mg/L)分别加入灭菌后的改良培养基中,并放置于厌氧箱中进行培养,筛选出对苯酚有较好耐受性的厌氧菌群,提取后在30 ℃、100 r/min下恒温振荡培养,得到JAC1培养液。

1.2.2 JAC1富集培养及群落结构测定

取出5 mL JAC1培养液转接到新的含有改良培养基的厌氧瓶中进行富集培养,上述操作均在厌氧培养箱中进行,利用紫外分光光度计测定JAC1培养液在600 nm下的吸光度(记为OD600),用以表征微生物的增长情况。当培养液OD600接近0.7时,说明微生物处于对数增长期,代谢活动旺盛,且数量较多,将此时的JAC1菌液用于后续的石油污染土壤降解能力分析和微生物群落结构解析。利用脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取JAC1菌群的基因组DNA,干冰保存后进行宏基因组测序。测序后利用Fastp软件对原始数据进行质控,利用Blastp与NR数据库进行比对,可获得微生物群落结构信息。

1.2.3 降解系统的构建及影响因素分析

向自封袋中装入50 g污染土壤样品,将一定JAC1菌液加入土壤样品中,挤出自封袋中的空气并放入厌氧培养箱培养,在培养第20、40、60、80天取样测定土壤中TPH含量,计算TPH降解率。TPH具体测定方法参考文献[8]。为考察土壤pH、NaCl含量、TPH浓度、接菌量等因素对于TPH降解效果的影响,设计单因子条件优化实验。在分析pH影响时,取50 g实际污染土壤样品,用稀HCl溶液与稀NaOH溶液调节土壤pH分别为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5,加入7.5 mL JAC1菌液搅拌均匀,分别进行厌氧降解实验;在进行TPH浓度分析时,将未受TPH污染的清洁土与实际污染土壤样品按一定比例混合,制备成TPH质量浓度为10、30、50、100 mg/kg的污染土壤样品,取50 g加入7.5 mL JAC1菌液搅拌均匀,分别进行厌氧降解实验;在考察NaCl含量影响时,取50 g实际污染土壤样品,采用NaCl溶液调节土壤样品中NaCl的质量浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,加入7.5 mL JAC1菌液搅拌均匀,分别进行厌氧降解实验;在分析接菌量的影响时,取50 g实际污染土壤样品,分别加入2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL JAC1菌液搅拌均匀,即接菌量分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL/g进行厌氧降解实验。每个条件设置3个平行样,同时以不加JAC1菌液的实际污染土样为对照组进行厌氧降解实验。

1.2.4 优化条件下厌氧降解过程动力学分析

采用一级动力学模型(见式(1))对TPH厌氧降解过程进行描述,根据式(2)计算TPH降解半衰期。

(1)

(2)

式中：C0为土壤中TPH初始质量浓度,mg/L;Ct为培养第t天土壤中TPH质量浓度,mg/L;K为一级降解速率常数,d-1;t为降解时间，d；t1/2为降解半衰期,d。

1.2.5 不同石油烃组分的分析

采用气相色谱质谱联用仪(GC/MS)对降解后土壤中不同石油烃组分进行分析。气相色谱柱采用DB-5石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),柱初温50 ℃,程序升温：升温速度15 ℃/min,至120 ℃;载气流速1.4 mL/min。质谱离子源为电子轰击源,离子源温度为250 ℃,电子轰击能量70 eV。

1.2.6 石油污染土壤降解前后群落结构组成分析

单因子优化条件实验结束后,取各影响因子中TPH降解率最高的土壤样品,等质量混合均匀,取5～10 g保存于无菌自封袋中,记为降解土；取未经处理的实际污染土壤记为原土,分别进行土壤微生物群落结构组成分析,测序方法同厌氧菌群JAC1群落结构测定方法。

1.3 数据存储

此次的宏基因组学原始序列已提交至美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库,检索号为SRX15405799、SRX15405800、SRX15405801、SRX15405802。

2 结果与讨论

2.1 厌氧菌群JAC1的群落结构

采用针对16S rRNA的338F/806R引物进行测序,获得JAC1中微生物群落结构组成信息,结果见表1。

表1 JAC1中微生物在属水平上的相对丰度Table 1 Relative percentage of community abundance in JAC1 at the genus level

由表1可见,菌群JAC1中的优势菌属依次为肠杆菌、克雷伯氏菌、硫酸盐还原菌、柠檬酸杆菌、沙雷氏菌。肠杆菌对轻质原油具有很好的降解效果[9],克雷伯氏菌在缺氧条件下能对菲进行厌氧降解[10],硫酸盐还原菌能够厌氧降解萘[11],柠檬酸杆菌在石油污染海域环境下可高效降解烷烃[12],从油泥沉积物中分离出的沙雷氏菌属对中长直链烷烃降解率较高[13]。郑金秀[14]认为,混合菌群具有协同降解共生作用,互相利用中间代谢产物,其降解效果较单菌有明显优势。

2.2 TPH降解条件的优化结果

pH会影响微生物对营养物质的利用和转化作用[15],pH过高或过低都会引起微生物电荷发生变化,从而抑制细胞酶的活性。土壤pH对TPH降解效果的影响见图1。在厌氧培养第80天时,pH为7.5的实验组TPH降解率最高,为53.42%,其次为pH为8.5的实验组,TPH的降解率为51.21%,其他实验组TPH的降解率均在50%以下。由此可知,pH在7.5～8.5时石油烃的降解效果最好。由于石油烃降解过程中会有大量有机酸代谢产物产生,导致土壤pH有一定程度降低[16],因此中性偏碱的环境更适合微生物对石油烃的厌氧降解。

图1 不同pH下的TPH降解率Fig.1 TPH degradation rates under different pH

土壤中TPH质量浓度对TPH降解效果的影响见图2。总体看来,随着土壤中TPH质量浓度的升高,TPH降解率呈现出先增大后减小的趋势,TPH为50 mg/kg的实验组石油烃降解效果最明显,厌氧培养第80天时TPH降解率达到54.50%。这是因为TPH浓度增加时,可以为土壤中的微生物提供更多有机碳源,有助于微生物的生长繁殖,然而TPH浓度达到100 mg/kg时,TPH降解率反而有所降低,这是因为高浓度的石油烃通常会聚集在土壤颗粒表面从而抑制微生物降解,同时会对微生物产生毒害,可见石油烃不仅是微生物的生长底物,同时也对微生物存在一定毒害作用[17]。

图2 不同TPH质量浓度下的TPH降解率Fig.2 TPH degradation rates under different TPH mass concentrations

土壤中NaCl质量分数对TPH降解效果的影响见图3。由图3可见,随着土壤中NaCl质量分数升高,TPH降解率呈现出先增大后减小的趋势,NaCl质量分数为0.3%的实验组石油烃降解效果最明显,厌氧培养第80天时TPH降解率达到56.18%。由此可知,适量的盐分可促进微生物的生长,但盐分含量过高,会对JAC1的生理机能产生不利影响，反而不利于TPH降解。

图3 不同NaCl质量分数下的TPH降解率Fig.3 TPH degradation rates under different NaCl mass fractions

土壤接菌量对TPH降解效果的影响见图4。由图4可见,厌氧培养第20天时,JAC1接菌量越高石油烃的降解效果越显著,随着厌氧培养的继续进行,JAC1接菌量为0.15 mL/g时石油烃的降解效果最佳,在第80天时TPH降解率达到55.40%。这是因为当JAC1接菌量过高时,培养后期会产生大量细菌代谢产物抑制细菌生长,导致石油烃降解速率缓慢。总体看来,JAC1的最佳接菌量为0.15 mL/g。

图4 不同接菌量下的TPH降解率Fig.4 TPH degradation rates under different inoculation quantity

2.3 JAC1对石油烃降解过程的动力学分析

由表2可知,不同条件下,石油烃的厌氧降解均符合一级动力学,相关系数R2均在0.9以上,这与李金成等[18]提出的微生物降解遵循一级动力学模型符合。一级降解速率常数K可用于指示不同条件下JAC1对石油烃的降解速率[19],K越大,石油烃降解速率越快,半衰期相应也会缩短。根据表2结果可知,JAC1降解石油烃的最优条件为pH 7.5～8.5,TPH质量浓度50 mg/kg,NaCl质量分数0.3%,接菌量0.15 mL/g。

2.4 石油烃的组分分析

以最优条件下进行厌氧降解的土壤样品为实验组,以不添加JAC1进行厌氧降解的实际土壤样品为对照组,对实验组与对照组中土壤残留组分进行GC/MS分析,计算出不同石油烃组分的降解率,结果见表3。

由表3可知,随着碳原子数的增加,石油烃组分降解率逐渐降低,其中C23H40的降解率最低,仅为11.0%,这表明芳香烃较直链烷烃更难降解。MAN等[20]研究发现,微生物降解石油烃的难易顺序为环烷烃>芳香烃>支链烷烃>直链烷烃,与本研究结论总体相符。实验中部分长链烷烃降解率高于短链烷烃,推测部分长链烷烃在降解过程中先分解为短链烷烃,然后再进行降解。因此,可以利用化学法将石油烃中难降解的组分分解为更容易被微生物利用的短链烷烃,从而进一步提高石油烃的去除效率。

2.5 降解前后土壤群落结构组成分析

石油烃降解过程中,土壤微生物群落存在演替现象。借助Diamond比对软件将测序数据与NR数据库进行比对,可以在不同分类层级上获得各种微生物的相对丰度。表4显示了原土与降解土在门水平和属水平上物种相对丰度分布情况。

从门水平上看,降解土微生物群落中主要菌门有变形菌门、放线菌门、广古菌门、拟杆菌门、厚壁菌门。与原土相比,降解土新增广古菌门微生物,相对丰度为4.05%,放线菌门和厚壁菌门的相对丰度有明显提高,拟杆菌门相对丰度明显减少。从属水平上看,降解土微生物群落中主要菌属有苯基杆菌属、厌氧黏细菌属、甲烷八叠球菌属、假单胞菌属和短波单胞菌属。与原土相比,降解土新增有甲烷八叠球菌属、短波单胞菌属微生物,由此可以判断此时甲烷生成处于活跃状态。可见,随着厌氧降解的进行,各种理化因子的综合作用驱动了土壤微生物群落的演替。

随着土壤中TPH浓度的逐渐降低,化学胁迫作用减弱,土壤中的微生物群落丰度有所增加,说明土壤微生物群落多样性与TPH浓度呈负相关。有研究表明,变形菌门、放线菌门和厚壁菌门与多环芳烃的降解密切相关[21]。变形菌门是土壤生物处理系统中的优势菌门,大部分参与有机物降解过程的微生物均属于此菌门。厚壁菌门在石油烃降解和有机物的厌氧发酵中发挥着关键作用[22]。厌氧黏细菌属已被证实对环境中重金属、石油烃污染具有重要的生物修复功能[23]。假单胞菌属中的一些物种属于兼性厌氧菌,能够在厌氧条件下降解多环芳烃[24]。甲烷八叠球菌属属于广古菌门,能在厌氧环境中利用有机物产生甲烷[25]。加入厌氧混合菌群JAC1后,土壤中上述功能菌群的相对丰度均呈现出不同程度升高,说明投加JAC1有助于建立一个高效的微生物降解体系来强化石油烃降解。

表2 不同条件下TPH的降解速率常数及半衰期Table 2 Degradaion rate constant and half-value period of TPH under different conditions

表3 石油烃中不同组分的降解率Table 3 Degration rate of different petroleum hydrocarbon compositions %

表4 门水平和属水平的物种相对丰度Table 4 Relative abundances of species at the phylum level and genus level

虽然厌氧条件下的TPH降解率相比于有氧条件下低,但鉴于地下深层和石油渗漏均属于缺氧环境,微生物活动主要以厌氧为主,因此厌氧降解在修复污染源较深、条件较差的石油污染地区来说仍然具有重要作用。通过GC/MS分析可知,芳香烃较直链烷烃更难降解,且芳香烃常与沉积物结合,降解机制较为复杂。由于石油烃在污染环境中易形成多环芳烃,而多环芳烃比较稳定,难于降解,对生态环境具有毒性,因此本研究用苯酚诱导来筛选微生物就可解决核心毒性,并起到降解石油烃的效果。微生物群落组成结构演替是综合作用的结果,群落之间存在相互代谢作用机制及复杂的能量转换与电子转移等,共养微生物可将污染物转化为甲烷,这对于微生物修复及能源回收具有积极意义。可见,通过微生物强化作用提高石油烃的降解代谢能力具有很大发展潜力。

3 结 论

(1) 单因子优化实验结果表明,厌氧菌群JAC1降解TPH的最佳条件为pH 7.5～8.5,土壤TPH质量浓度50 mg/kg,NaCl质量分数0.3%,接菌量0.15 mL/g,不同条件下的TPH降解均符合一级动力学模型。

(2) 随着碳原子数增加,JAC1对石油烃组分的降解率逐渐降低。芳香烃较直链烷烃更难降解,部分长链烷烃可能先分解为短链烷烃后再被降解。

(3) 土壤微生物群落多样性与TPH浓度呈负相关,投加JAC1后土壤中与石油烃降解有关的功能菌群相对丰度呈现出不同程度升高,说明投加JAC1有助于建立一个高效的微生物降解体系来强化石油烃降解。