siRNA靶向干扰circ_0055625表达对胃癌细胞增殖及转移的影响

刘奕明 孙银平 钟平玉 杨柏炜（福建医科大学附属龙岩第一医院消化内科，龙岩 364000）

胃癌是威胁我国人民生命安全的消化道恶性肿瘤之一，每年全球胃癌的发病例数超过103万例，且病死率在所有肿瘤中占据第三位，由于胃癌早期症状较为隐匿导致40%左右的患者确诊时已发生转移，治疗后胃癌患者五年生存率<10%，因而抑制胃癌转移是提高胃癌治疗效果及改善患者预后的关键［1］。环状RNA（circular RNA，circRNA）是由前体mRNA通过剪切形成的闭合环状RNA分子，其具有稳定性与组织特异性，并可通过吸附微小RNA（miRNA）而参与翻译蛋白等多种生物学过程从而参与肿瘤发生发展过程。近年来，越来越多的研究表明circRNA可调控胃癌细胞增殖、侵袭等多种生物学行为，并可能作为胃癌治疗的潜在靶点［2-4］。circ_0055625在结肠癌细胞中呈高表达，并可通过吸附miR-106b-5p而促进细胞增殖及转移［5］。但circ_0055625在胃癌中的表达及其可能生物学功能尚未可知。通过靶基因预测网站预测显示circ_0055625与miR-1225-3p存在结合位点，研究表明miR-1225-3p在非小细胞肺癌中呈低表达，上调其表达可抑制非小细胞肺癌细胞转移［6］。但circ_0055625/miR-1225-3p轴在胃癌形成及转移过程中的作用机制尚未可知。因此，本研究主要探讨circ_0055625是否可通过靶向调控miR-1225-3p的表达从而影响胃癌细胞增殖及转移，为胃癌的治疗提供潜在靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料收集2019年1月至2020年6月于福建医科大学附属龙岩第一医院进行胃癌根治术的55例胃癌患者的癌组织及其癌旁组织（癌组织>5 cm范围外正常组织）标本，于液氮中保存，其中 男35例，女20例，年 龄46~67岁，平 均 年 龄（53.68±7.49）岁。所有组织标本均经病理诊断确诊。本研究经福建医科大学附属龙岩第一医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂与仪器人胃癌细胞AGS购自湖南丰晖生物；DMEM培养基购自美国Hyclone；胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Trizol试剂、circ_0055625过表达载体（pcDNA-circ_0055625）及其对照空载体（pcDNA）购自美国Invitrogen；反转录试剂与qRTPCR试剂购自北京天根生化；circ_0055625小分子干扰RNA（si-circ_0055625）及其阴性对照（si-NC）、miR-1225-3p寡核苷酸模拟物（miR-1225-3p mimics）及阴性对照mimic NC序列（miR-NC）、miR-1225-3p特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-1225-3p）及其阴性对照（anti-miR-NC）购自广州锐博生物；MTT试剂、Matrigel基质胶购自北京索莱宝；Transwell小室购自美国Corning；兔抗人vimentin、YAP-1多克隆抗体购自沈阳万类生物；兔抗人Snail多克隆抗体、二抗购自美国Abcam；蛋白质提取相关试剂与SDS凝胶电泳相关试剂购自上海碧云天生物；低温离心机购自美国Thermo Fisher；EON型酶联免疫检测仪购自美国Bio-Tek；Nikon ECLIPSE Ti-S荧光倒置显微镜购自日本尼康；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI；DYY-6C型双稳定电泳仪购自北京六一生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及分组AGS细胞常规培养，按1×105个/孔的密度接种于直径为6 cm的培养皿中，待细胞生长融合度达到70%左右时用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent进行转染，每孔取4μg的si-NC、si-circ_0055625、miR-NC、miR-1225-3p mimics、si-circ_0055625与anti-miR-NC（共转染）、si-circ_0055625与anti-miR-1225-3p（共转染）分别进行转染，转染6 h后将培养基更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养24 h，分别记为si-NC组、si-circ_0055625组、miR-NC组、miR-1225-3p组、si-circ_0055625+anti-miR-NC组、si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p组。

1.2.2 qRT-PCR检 测circ_0055625、miR-1225-3p的表达水平收集各组AGS细胞与癌旁组织、胃癌组织，采用Trizol法分别提取组织标本与细胞的总RNA，反转录合成cDNA。PCR扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10μl、正反向引物各0.8μl、cDNA 2μl、ddH2O补足体系至20μl；反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循环。circ_0055625以GAPDH为内参，miR-1225-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖取各组AGS细胞按照3 000个/孔接种于96孔板，于培养箱内培养12 h后，每孔分别加入MTT溶液20μl继续培养4 h，3 000 r/min离心5 min后弃上清，每孔分别加入150μl DMSO，室温避光孵育5 min，应用酶标仪检测各孔光密度值（OD）。细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.4克隆形成实验取各组AGS细胞悬液接种于6孔板（500个/孔），于培养箱内培养12 d（0肉眼可见克隆），每2 d更换1次培养基，终止培养后用4%多聚甲醛固定30 min，1%结晶紫染色液染色20 min，计算克隆形成数。

1.2.5 划痕实验将各组AGS细胞按照1×104个/孔接种于6孔板，待细胞生长融合度达到90%时用10μl移液枪的枪头在6孔板的中间划线，PBS冲洗划掉的细胞后再加入2 ml含有10%胎牛血清的培养液，此时记为0 h，于培养箱内培养24 h后在相同位置拍照并应用Image J软件计算细胞划痕距离，计算划痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭用不含血清的DMEM培养基按照1∶5的比例稀释Matrigel基质胶，将其加入小室的上室（30μl/孔）后于培养箱内孵育3 h，然后加入各组AGS细胞（2×104个/ml）400μl，小室的上室，下室中加入600μl含有10%胎牛血清的DMEM培养基，于培养箱内培养48 h后取出小室，PBS洗涤细胞后用4%多聚甲醛固定20 min，0.05%结晶紫染色液染色20 min，PBS洗涤后晾干，于倒置显微镜下计数细胞。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测circ_0055625与miR-1225-3p的靶向关系Circular RNA Interactome预测显示circ_0055625与miR-1225-3p存在结合位点，用点突变试剂盒将结合位点进行突变，分别构建含有结合位点与突变位点的荧光素酶报告基因载体（野生型载体WT-circ_0055625、突变型载体MUT-circ_0055625），利用LipofectamineTM3000 Trans⁃fection Reagent试剂盒分别将WT-circ_0055625、MUT-circ_0055625与miR-NC或miR-1225-3p mimics共转染至AGS细胞，将其置于培养箱内培养24 h后收集细胞并检测荧光素酶活性。分别将si-NC、si-circ_0055625、pcDNA、pcDNA-circ_0055625转染至AGS细胞24 h后收集细胞并采用qRT-PCR实验检测miR-1225-3p的表达量。

1.2.8 Western blot检测Snail、Vimentin、YAP-1蛋白表达收集各组AGS细胞后加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，取40μg蛋白样品进行10%SDSPAGE电泳分离蛋白，用210 mA恒流的方式将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入Snail（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、YAP-1（1∶1 000）一抗与内参GAPDH抗体（1∶3 000）稀释液，4℃孵育过夜后TBST洗膜，加入二抗稀释液（1∶5 000）37℃孵育1 h后TBST洗膜，电化学发光液显影，应用Image J软件分析各条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析采用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以±s表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，Pearson法进行相关性分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_0055625与miR-1225-3p在胃癌组织及癌旁组织中的表达与癌旁组织比较，胃癌组织中circ_0055625的表达量升高（P<0.05），miR-1225-3p的表达量降低（P<0.05），见表1。Pearson法分析胃癌组织中circ_0055625与miR-1225-3p表达量的相关性，结果显示circ_0055625与miR-1225-3p呈负相关（r=-0.881 6，P<0.001），见图1。

图1 胃癌组织中circ_0055625与miR-1225-3p表达量的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of circ_0055625 and miR-1225-3p expression in gastric cancer tissues

表1 circ_0055625与miR-1225-3p在胃癌组织及癌旁组织中的表达量（±s，n=55）Tab.1 Expression of circ_0055625 and miR-1225-3p in gastric cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=55）

表1 circ_0055625与miR-1225-3p在胃癌组织及癌旁组织中的表达量（±s，n=55）Tab.1 Expression of circ_0055625 and miR-1225-3p in gastric cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=55）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P<0.05.

Groups Adjacent tissues Gastric cancer tissues t P circ_0055625 1.00±0.11 3.46±0.621）28.973 0.000 miR-1225-3p 1.00±0.18 0.36±0.091）23.585 0.000

2.2 干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响与si-NC组比较，si-circ_0055625组细胞存活率降低（P<0.05），克隆形成数和侵袭细胞数减少（P<0.05），划痕愈合率降低（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平降低（P<0.05），见图2、表2。

表2 干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

表2 干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Groups si-NC si-circ_0055625 t P circ_0055625 1.00±0.04 0.28±0.051）33.734 0.000 Cell survival rate（%）99.69±3.87 35.73±4.611）31.879 0.000 Number of clones formed 114.44±10.75 45.33±8.721）14.978 0.000 Scratch healing rate（%）56.06±2.86 25.88±5.501）14.605 0.000 Number of invasion cells 137.67±7.83 55.11±6.571）24.232 0.000

图2 干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响Fig.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migra⁃tion and invasion of AGS cells

2.3 双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验验证circ_0055625与miR-1225-3p的靶向调控关系Cir⁃cular RNA Interactome预 测 显 示circ_0055625与miR-1225-3p存在结合位点，见图3A。上调miR-1225-3p表达可降低野生型载体WT-circ_0055625的荧光素酶活性（P<0.05），而对突变型载体MUTcirc_0055625的荧光素酶活性无显著影响，见图3B。与si-NC组比较，si-circ_0055625组miR-1225-3p的表达量升高（P<0.05）；与pcDNA组比较，pcDNAcirc_0055625组miR-1225-3p的 表 达 量 降 低（P<0.05），见图3C。

图3 circ_0055625与miR-1225-3p的靶向调控作用Fig.3 Targeted regulatory effects of circ_0055625 and miR-1225-3p

2.4 上调miR-1225-3p表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响与miR-NC组比较，miR-1225-3p组细胞存活率降低（P<0.05），克隆形成数和侵袭细胞数减少（P<0.05），划痕愈合率降低（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平降低（P<0.05），见图4、表3。

表3 上调miR-1225-3p表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

表3 上调miR-1225-3p表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with the miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-1225-3p t P miR-1225-3p 1.00±0.05 3.12±0.081）67.416 0.000 Cell survival rate（%）99.64±3.26 57.62±4.091）24.309 0.000 Number of clones formed 113.33±11.75 52.67±9.381）12.104 0.000 Scratch healing rate（%）56.13±4.67 23.54±3.661）16.478 0.000 Number of invasion cells 136.22±8.89 70.67±4.851）19.419 0.000

图4 上调miR-1225-3p表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响Fig.4 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells

2.5 抑制miR-1225-3p表达部分逆转干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的抑制作用与si-circ_0055625+anti-miR-NC组比较，si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p组细胞存活率升高（P<0.05），克隆形成数和侵袭细胞数增多（P<0.05），划痕愈合率升高（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平升高（P<0.05），见表4、图5。

表4 抑制miR-1225-3p表达部分逆转干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effects of interference with circ_0055625 expres⁃sion on AGS cell proliferation，clone formation，migration and invasion（±s，n=9）

表4 抑制miR-1225-3p表达部分逆转干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effects of interference with circ_0055625 expres⁃sion on AGS cell proliferation，clone formation，migration and invasion（±s，n=9）

Note：Compared with si-circ_0055625+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups si-circ_0055625+anti-miR-NC si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p t P miR-1225-3p 1.00±0.05 0.41±0.041）27.643 0.000 Cell survival rate（%）35.85±4.97 79.94±5.451）17.933 0.000 Number of clones formed 45.33±2.24 85.11±8.101）14.200 0.000 Scratch healing rate（%）25.28±3.07 47.02±3.221）14.660 0.000 Number of invasion cells 55.11±6.05 93.78±6.281）13.304 0.000

图5 抑制miR-1225-3p表达部分逆转干扰circ_0055625表达对AGS细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的抑制作用Fig.5 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effect of interference with circ_0055625 expression on proliferation，clone forma⁃tion，migration and invasion of AGS cells

3 讨论

circRNA广泛存在于真核细胞中，其主要是由外显子与内含子构成的一种共价闭合环状RNA分子，其在肿瘤发生及发展过程中可发挥重要调控作用，同时circRNA分子富含miRNA的结合位点，并可在细胞中发挥miRNA海绵的作用，circRNA_100782、circRNA_100876在胃癌细胞中表达上调，并可发挥miRNA海绵的作用而调控其靶基因表达从而促进胃癌细胞增殖及转移［7-8］。circRNA_0005075、circ_0000190、circ_0004872、circRHOBTB3

在胃癌细胞中表达下调，并可通过调节miRNA/靶mRNA表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭从而抑制胃癌进展［9-12］。

circ_0055625在结肠癌患者血清中表达上调且与化疗耐药性有关［13］。但circ_0055625在胃癌中的表达及其可能作用机制尚未见报道。本研究结果显示，胃癌组织中circ_0055625的表达量高于癌旁组织，通过体外细胞实验证实，siRNA靶向干扰circ_0055625表达后胃癌细胞存活率降低且克隆形成数减少，提示干扰circ_0055625表达可抑制胃癌细胞增殖及克隆形成。YAP-1属于Hippo/YAP通路的关键蛋白，上皮-间质转化是肿瘤细胞迁移及侵袭的重要环节，其可通过将上皮细胞重构后促使细胞失去黏合连接进而导致细胞转移，YAP-1表达上调可促进转录因子Snail表达进而上调Vimentin的表达［14-15］。本研究结果显示，干扰circ_0055625表达后胃癌细胞侵袭细胞数减少且划痕愈合率降低，并可抑制Snail、Vimentin、YAP-1蛋白表达，提示干扰circ_0055625表达后可抑制胃癌细胞迁移及侵袭。

circ_0055625与胃癌细胞生物学功能的相关性研究尚未见报道，本研究通过在线靶基因预测显示circ_0055625与miR-1225-3p存在结合位点，并检测到胃癌组织中miR-1225-3p的表达量低于癌旁组织，且胃癌组织中circ_0055625与miR-1225-3p表达量呈负相关，提示circ_0055625可能通过靶向结合miR-1225-3p而负向调控其表达进而参与胃癌发生发展过程。研究表明miR-1225-3p在骨肉瘤中表达量降低，circ_0016347通过调节miR-1225-3p/KCNH1表达而促进骨肉瘤进展［16］。miR-1225-3p在胆道癌、结直肠癌中表达下调，并可能作为肿瘤早期诊断及评估患者预后的潜在标记物［17-18］。本研究通过双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验证实circ_0055625可靶向调控miR-1225-3p的表达，上调miR-1225-3p表达可抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭，而抑制其表达可拮抗干扰circ_0055625表达对胃癌细胞增殖及转移的抑制作用。提示circ_0055625可通过靶向结合miR-1225-3p而抑制其表达从而促进胃癌细胞增殖及转移。

综上所述，胃癌组织中circ_0055625表达上调，而miR-1225-3p的表达下调，二者存在负相关关系且存在靶向结合作用，干扰circ_0055625表达可通过上调miR-1225-3p表达而抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭，可为进一步揭示胃癌的发病机制奠定实验基础，还可为胃癌的治疗提供潜在靶点。但circ_0055625序列上富含多个miRNA结合位点，其是否可通过调控其他miRNA表达而参与胃癌发生、发展过程尚需进一步探究。