miR-383-5p靶向ZEB2抑制食管癌细胞侵袭及间质转化①

王小娟 张珺 鲜胜 邓猛 韩春俐（武汉市第五医院检验科，武汉 430050）

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是全球常见的恶性消化道疾病之一，是癌症相关死亡的第六大原因，其发病率及病死率逐年升高［1］。EC症状隐匿，往往会延误诊断，导致患者确诊时已进入晚期，五年生存率不足15%［2］。手术切除、化疗、放疗等在一定程度上可缓解EC发展，但其术后风险及副作用不容忽视［3］。因此，寻找新的生物标志物来协助EC的早期诊断和靶向治疗迫在眉睫。

微小核糖核酸（miRNA）是一种长度为18~25个核苷酸的单链、进化高度保守的小分子非编码RNA［4］。由于不具备开放阅读框等条件而无法编码蛋白质，miRNA可通过与靶mRNA特异性识别结合，抑制靶mRNA翻译或影响其稳定性，从而调控基因表达；同时，miRNA通过影响肿瘤形成相关的基因和传导通路调控肿瘤的发生发展，发挥促进或抑制作用［5］。其中，miR-383-5p通过靶向作用显著抑制肿瘤细胞生长，缓解疾病进程，如非小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌等，但未见miR-383-5p与EC的关系［6-8］。因此，本研究探讨miR-383-5p过表达对EC细胞增殖、侵袭及上皮-间质转化（epithelial-mesen⁃chymal transition，EMT）的影响，以期为EC的临床诊断、靶向治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源人EC细胞Eca-109购自中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 主要试剂10%胎牛血清、RPMI1640培养基、脂质体Lipofectamine®3000购自美国Thermo公司；miR-383-5p模拟物（mimics）、阴性对照（NC）序列购自上海吉凯基因有限公司；ZEB2过表达质粒购自北京傲锐东源生物科技有限公司；RNA提取试剂TRIzol、RT-PCR试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；逆转录试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；ZEB2、Actin等及相关抗体购自上海艾博抗有限公司；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、E-钙黏蛋白（E-cad）、N-钙黏蛋白（Ncad）等相关抗体购自美国Thermo Fisher公司；荧光素酶检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司，荧光素酶报告载体由该公司合成。

1.1.3 主要仪器HBS-1096A酶标分析仪购自南京德铁实验设备有限公司；Microfuge 20R离心机购自美国贝克曼库尔特公司；DYC-ZY2电泳仪、垂直电泳槽购自北京东方瑞利科技有限公司；HTC-150恒温恒湿培养箱购自上海三腾仪器有限公司；Transwell小室购自美国康宁公司；SW-CJ-2D垂直超净无菌工作台购自江苏博莱尔有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将冻存的Eca-109细胞水浴复苏，接种于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI-1640培养基，置于37℃、含5%CO2的恒温培养箱中培养，待细胞融合度达到85%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化并传代，用于后续实验研究。

1.2.2 RT-PCR验证过表达效率调整细胞密度为1×105个/孔，接种于6孔板，待融合度达60%时更换无血清培养基，采用脂质体Lipofectamine®3000向Eca-109细胞中分别转染200 nmol miR-383-5p模拟物（过表达组）和阴性对照序列（NC组），并设置未转染的细胞为空白对照组。向转染后的细胞中加入1 ml TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，再根据PCR试剂盒说明书配制反应溶液，进行PCR反应。以2-ΔΔCt公式计算miR-383-5p表达量，选择U6为内参基因，实验重复3次，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.2.3 荧光素酶报告基因实验 利用Targetscan数据库（http：//www.targetscan.org/）预测miR-383-5p的潜在靶点，结果显示ZEB2可能是miR-383-5p的靶点，采用荧光素酶实验验证二者的靶向关系。通过向pGL3-basic载体中插入ZEB2 3'UTR区与miR-383-5p结合的种子序列（CUGAUCUA）构建荧光素酶报告受体Luc-ZEB2-3'UTR-wt；构建突变型荧光素酶载体Luc-ZEB2-3'UTR-mut，将miR-383-5p mimics和NC序列分别以Lipofectamine3000转染细胞，48 h后，试剂盒检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.2.4 RT-PCR检测ZEB2 mRNA表达根据相应试剂盒说明，分别进行引物设计、总RNA提取、反转录、定量PCR，以2-ΔΔCt法计算ZEB2的相对mRNA表达水平，重复3次。

1.2.5 Western blot检测ZEB2表达为进一步验证miR-383-5p对ZEB2的调节作用，将细胞分为空白对照组、单独转染miR-383-5p组、单独转染ZEB2组、联合转染miR-383-5p/ZEB2组。采用RIPA裂解液裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。分别取各组约30μg蛋白加入10%SDS-PAGE体系，将目的条带转膜并封闭2 h，加入稀释后的ZEB2、Actin一抗，4℃孵育过夜。加入稀释的二抗，2 h后加入ECL工作液显影，在凝胶成像系统中观察并拍照，统计灰度值并计算ZEB2表达量。

1.2.6 CCK8法检测细胞增殖采用CCK8试剂盒检测细胞增殖水平，将各组细胞密度调整至1×105个/ml，以200μl/孔接种至96孔板，于37℃、含5%CO2的培养箱中分别培养4 d，每孔加入20μl CCK8溶液，37℃孵育2 h。酶标仪检测450 nm处光密度值。

1.2.7 Transwell检测细胞侵袭将Matrigel胶用PBS稀释后，包被于Transwell小室底膜上室，下室加入800μl含10%血清的培养基，分别取各组Eca-109细胞，调整密度为1×105个/ml，接种100μl于上室，置于培养箱中48 h后取出侵袭小室，PBS冲洗培养基，将小室内层未穿膜的细胞用湿润的棉球擦除。以预冷的4%多聚甲醛固定处理后，采用0.1%结晶紫溶液染色并进行显微镜观察。

1.2.8 Western blot检测侵袭相关蛋白VEGF、EMT标志蛋白E-cad，N-cad表达采用VEGF、E-cad、N-cad相关抗体进行实验，具体操作同1.2.5。

1.3 统计学方法采用SPSS21.0软件进行数据分析，选择单因素方差分析比较各组间的显著性差异，数据以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-383-5p与ZEB2的靶向关 系验证Tar⁃getscan程序在线预测发现ZEB2基因3'UTR区含有miR-383-5p的潜在互补结合位点（图1A）。双荧光素酶报告基因实验表明，经miR-383-5p mimics处理后，转染野生型ZEB2 3'UTR质粒的细胞相对荧光强度低于转染突变型质粒的细胞（P<0.05，图1D）。与空白组相比，NC组差异无统计学意义；与NC组相比，miR-383-5p组miR-383-5p表达明显增多（P<0.05，图1B），而ZEB2 mRNA表达明显减少（P<0.05，图1C）。

图1 miR-383-5p与ZEB2的靶向关系验证Fig.1 Verification of targeting relationship between miR-383-5p and ZEB2

2.2 ZEB2过表达与Control组相比，pcDNA组ZEB2 mRNA水平和蛋白表达无明显差异，pcDNAZEB2组ZEB2 mRNA水平和蛋白表达均明显升高（P<0.05，图2），提示ZEB2过表达成功。

图2 ZEB2过表达对Eca-109细胞ZEB2 mRNA水平和蛋白表达的影响Fig.2 Effects of ZEB2 overexpression on ZEB2 mRNA level and protein expressions in Eca-109 cells

2.3 miR-383-5p通过下调ZEB2抑制Eca-109细胞增殖与空白组相比，单独转染miR-383-5p组ZEB2表达明显减少（P<0.05），单独转染ZEB2组ZEB2表达明显增多（P<0.05）；与ZEB2组相比，miR-383-5p/ZEB2联合转染组ZEB2表达明显降低（P<0.05）。此外，与ZEB2组相比，miR-383-5p/ZEB2联合转染组Eca-109细胞增殖率明显降低（P<0.05）。见图3。

图3 miR-383-5p对Eca-109细胞增殖的影响Fig.3 Effect of miR-383-5p on proliferation of Eca-109 cells

2.4 miR-383-5p通过下 调ZEB2抑制Eca-109细胞侵袭 与空白组相比，单独转染miR-383-5p组侵袭细胞数明显减少（P<0.05）；单独转染ZEB2组侵袭细胞数明显增多（P<0.05）；与单独转染ZEB2组相比，miR-383-5p/ZEB2联合转染组侵袭细胞数明显减少（P<0.05）；Western blot结果表明VEGF的表达趋势与Transwell检测结果吻合。见图4。

图4 miR-383-5p对Eca-109细胞侵袭的影响Fig.4 Effect of miR-383-5p on invasion of Eca-109 cells

2.5 miR-383-5p通过下调ZEB2抑制Eca-109细胞EMT与空白组相比，单独转染miR-383-5p组E-cad表达明显减少、N-cad表达明显增多（P<0.05）；单独转染ZEB2组E-cad表达明显增多、N-cad表达明显减少（P<0.05）；与单独转染ZEB2组相比，miR-383-5p/ZEB2联合转染组E-cad表达明显减少、N-cad表达明显增多（P<0.05）。见图5。

图5 miR-383-5p对Eca-109细胞EMT的影响Fig.5 Effect of miR-383-5p on Eca-109 cell EMT

3 结论

miRNA与肿瘤的形成密切相关，当正常组织发生癌变时，miRNA的表达有明显变化。此外，miRNA在肿瘤的增殖、凋亡、转移、侵袭、浸润等方面发挥促进或抑制作用，又在肿瘤的诊断和治疗等方面具有重要意义［5］。其中，miR-383-5p在肿瘤的早期诊断、靶向治疗、预后检测等方面发挥重要作用。ZHANG等［9］研究显示，miR-383-5p可作为乳腺癌的预后标志物和肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的抑制剂；XU等［10］的报道指出，靶向HDAC9表达可调控胃癌进展；ZHAO等［11］研究表明，蛋白磷酸酶2A癌抑制剂可作为肺腺癌的预后标志物抑制细胞增殖；JIANG等［12］研究指出，通过靶向TRIM27可抑制卵巢癌细胞的增殖并增强化疗敏感性。本研究通过靶向实验证实ZEB2的3'UTR区存在与miR-383-5p靶向结合的碱基互补区，初步确定miR-383-5p可靶向作用 于ZEB2的3'UTR区，miR-383-5p可在 转 录后水平负性调控ZEB2表达；探讨miR-383-5p下调ZEB2对EC细胞炎症因子水平、增殖、侵袭及EMT的影响。

EMT是调控肿瘤细胞侵袭和转移的机制之一，上皮标志物E-cad的减少和间质标志物波形蛋白、N-Cad等的增加使细胞紧密连接、极性丢失、间充质细胞形态转变，导致肿瘤细胞黏附作用减弱，但运动能力增强，从而获得更强的迁移和侵袭能力［13-14］。如miR-205通过下调HOXD9抑制人胶质瘤EMT，减轻细胞运动能力，抑制肿瘤生长［15］。此外，VEGF是调节肿瘤侵袭的重要调控因素。miR-718可通过下调VEGF表达抑制卵巢癌细胞侵袭［16］。本研究显示，联合转染组EMT相关蛋白E-cad表达减少、N-cad表达增多，且侵袭细胞数及VEGF表达均明显减少，与上述研究一致，提示miR-383-5p通过下调ZEB2抑制Eca-109细胞的侵袭及EMT。

综上，miR-383-5p能够靶向下调ZEB2，进而抑制Eca-109细胞增殖、侵袭及EMT，缓解EC的发生发展，具有靶向治疗EC的潜力及深入研究的意义。