STR基因座突变对亲子鉴定准确性的影响探讨

包杰 张静 陈丹

河南省生殖健康科学技术研究院 河南事缘法医物证司法鉴定所 河南 郑州 450002

引言

STR即短串联重复序列，又称为见微卫星DNA，核心序列包括2～7bp，属于高度串联重复序列，重复次数在几次到几十次不等。短串联重复序列符合孟德尔遗传定律，在基因组内有着广泛的分布，存在着高杂合度以及高度多态性，检测难度小，在目前的法医学遗传标记中应用十分广泛，完全可以满足亲子鉴定以及个体识别的应用需求。另一方面，因为STR基因座突发概率较大，在亲子鉴定方面对结果的准确性也有着一定的影响，必须要谨慎对待，将其带来的不利影响降到最低。

1 STR基因座突变规律

1.1 STR突变规律

STR基因座现在常被用于亲子鉴定，但是其突变率可以达到0～7×10-3，会对鉴定结果的准确率产生影响。为排除这一影响，就需要掌握STR的突变规律，提前做好预防和处理[1]。根据研究可以确定，STR基因座突变原因是DNA复制滑动，符合逐步突变模式。每次突变只有一个重复单位被改变，在上一次突变的基础上可以继续发生两个或多个单位的变化，由此可确定多步突变是逐步形成的。

1.2 STR突变步数

STR等位基因发生突变，基本上均是重复单位数的改变，每个突变均对应着一个或数个重复单位的增多/减少。超过90%的STR突变只有一个重复单位的增多/减少，为一步突变。二步突变的概率不足10%，可见多步突变的概率更小[2]。

1.3 STR突变来源

根据统计可确定STR突变主要来源于父方，可以达到母方的0.7～14倍，多数基因座为3～6倍。一旦STR基因座发生突变，将会造成重复单位数增加或减少，而这一概率父方与母方概率相同，只有较小的概率会增加重复单位。

1.4 STR突变率

影响STR基因座突变的重要因素是其多态性的高低，重复单位数目越多相应的基因座长度就越长，多态性也会更高，因此发生突变的概率更高，如D21S11、FGA等。突变率与完整重复单位连续不间断的长度几何平均值为正相关，甚至是指数关系。

1.5 突变的等位基因

即便是一个基因座，等位基因之间的突变概率也有着较大的差异，主要是因为等位基因的完整重复单位数不同。重复单位相同且连续相连，不被不完整重复单位打断的较长的等位基因，发生突变的概率更高。此种重复序列在不同的位置均有可能出现复制滑动的情况。正常情况下，存在连续10个以上的重复单位更容易发生突变。

1.6 其他

随着父亲年龄的增大，STR基因组发生突变的概率会一定的增长。另外，经过观察X和Y染色体STR突变数据，可以发现性染色体STR突变规律以及突变率与常染色体STR突变没有明显差异。

2 STR基因座突变后非父排除率

在不考虑突变的情况下，检测的一系列遗传标记中出现任何一个排除亲子关系的概率即累积非父排除率。一旦STR基因组出现突变，便需要有至少两个遗传标记才可以排除亲子关系。经过研究可以确定，检测Power Plex 16系统允许三个基因座突变的累积费父排除率＞0.99，检测24个STR允许三个三个基因座突变的累积费父排除率＞0.9999[3]。

3 STR基因座突变下父权指数计算

3.1 平均突变父权指数

在基因座发生突变的情况下，假如被检测男子为真正生父，但是受突变影响出现排除亲子关系分型结果的概率与突变率一致。被检随机男子并非生父，出现的排除亲子关系分型结果的概率是非父排除率。基于PI定义分析，PI为两种情况下概率的比值：AMPI=μ/PE。其中μ表示基因座突变率，PE表示非父排除率[4]。应用此种方法计算，最终得到的AMPI值至于PE大小相关，与被检男子的具体基因分型并不相关。

3.2 传递概率计算法

传递概率计算法的原理于无突变情况下的PI值计算方法一致，只是突变亲代传递等位基因给后代的概率有所改变，与等位基因的突变概率相同。此种方法计算，主要与争议父基因型相关，需要以基因分型信息为支持，得到更具有针对性的PI值。现在对于STR基因座突变的研究越来越多，掌握了越来越多的突变数据，但是多数只能够使用整个基因座的突变率。传递概率法计算则是需要应用到特异等位基因突变概率，要根据基因座突变率推算得到等位基因的突变概率才可以。由此就决定了此种方法计算过程的复杂性，实际应用中要格外注意。

3.2.1 突变模型。STR等位基因突变概率的计算模型包括等概率模型、递减模型、成比例模型、验性递减模型以及逐步稳态模型。其中，等概率模型以及成比例模型均与逐步突变模型不符。递减模型符合SMM，将突变概率和重复序列长度变化之间的关系纳入到考虑范围内，且对等位基因频率数据库中内有的新等位基因情况也进行了综合分析，只是未针对与等位基因频率之间的非稳态关系进行分析。经验性低价模型的原理更为简单，利用Ms表示等位基因发生s（s＞1）步突变概率，则Ms≈（1/2）（1/10）|s-1|。逐步稳态模型不仅考虑了突变概率和重复序列长度变化的关系，同时还考虑了不同等位基因突变概率有所差异的情况。此模型同时符合SMM和群体等位基因频率稳定不变的要求，相比其他几种模型，在基因突变概率方面的计算方面理论上应用效果最好。

3.2.2 突变率性别比。存在较多的研究表示父方与母方之间的突变概率有所差异，这样在计算突变PI值时，也需要将此方面的突变率性别差异纳入到考虑范围内。例如Brenner按照女性突变率是男性突变率的1/3.5进行PI值计算。

3.2.3 突变方向。虽然在一些研究中STR突变多趋向于增加重复单位，但是在计算等位基因突变率时，往往都是采用突变重复序列增加或减少机会相等的算法进行计算。

3.2.4 一步突变与多步突变。部分情况下孩子等位基因是通过亲代一步突变或者多步突变而来，例如母方基因型为12，13，孩子基因型为13，14，父方基因型为15，16。对于多步突变（16突变成14）的情况是否也需要纳入考虑，目前尚未完全统一。但是实际上基因座发生二步甚至多步突变的概率是非常小的，以及几乎不对对最终PI值的准确性产生影响，大多数情况对其是忽略不计的。

3.2.5 非整数步突变。假如D24S11基因座中，母方基因型为29，30，孩子基因型为30，31，父方基因型是32，33，就可以判断存在非整数突变。但是此种非整数重复单位改变的情况下在STR基因座突变中的可能性非常小。其有可能不是重复序列的改变，而是重复序列侧翼序列的改变，无论是选择逐步稳态模型还是经验递减模型进行计算，均无法得到准确的等位基因突变概率，影响最终鉴定结果可靠性。

3.2.6 父、母均有突变可能性。例如母方基因型为12，13，孩子基因型为12，14，父方基因型为12，15。可以说明父母均有基因座突变的可能性，那么在进行计算时需要考虑母方的突变可能性吗？相比来讲，如果将母方突变纳入到考虑范围内，最终的计算结果将会对PI值产生明显的影响。虽然在亲子鉴定的实施中基本上是认定父方突变，但是对于部分特殊案例也有着极大的情况，不能够完全忽视母方突变的可能性。

4 STR基因座突变对亲子鉴定准确性影响注意要点

4.1 初步判定突变

在对一定数量的STR基因座进行检测后，发现其中之后少数 几个基因座排除亲子关系的情况下，不排除存在突变的可能。一般情况下因为基因座的多态性、突变率以及亲子关系认定水平等特点，对于存在的几个的实际数量并没有明确规定。应用PowerPlex 16与AmpFLSTR Identifler系统时，假如可以检出15个STR的基因型，存在3个以内的基因座排除亲子关系，便可怀疑存在突变。其他不排除亲子关系基因座的累积非父排除率可以达到99%以上。如果存在4个及以上也无法排除STR突变的可能性，只能够确定突变的概率比较小。

4.2 增多基因座数目

测序是可以鉴定是否存在突变的有效方法，其中需要增加检测的遗传标记数，可以通过累积非父排除率进行估计。累积非父排除率越高以及允许突变基因座越多的情况下，需要检测的遗传标记也就越多。并且，对于需要增加检测遗传标记的情况，依然存在着新突变发生的可能。

4.3 区分突变情形

4.3.1 沉默等位基因。如果出现亲代一方与孩子全部表现为纯合子的情况，如母方分型为29，30，孩子分型是30，父方分型为32，便需要注意因等位基因漏扩产生的沉默等位基因。沉默等位基因基本上均是引物和模板间不配对导致，可选择不同引物或试剂盒检测，还可以通过改变扩增条件来进行证实。以ISFG要求为依据，要对沉默等位基因基因座的PI值进行计算。

4.3.2 亲属个体代替检验。存在亲缘关系的个体之间具有相同等位基因的可能性要高于随机个体之间的概率。假如与生父存在亲缘关系的个体代替生父进行亲子鉴定，便有一定的可能性检测出被检男子与孩子之间存在个别基因座排除亲子关系的可能性。但是被检测的基因座数目越多，则出现这种情况的可能性也越低。

4.3.3 单亲二体。子代一对染色体完全来自母方或父方，如果是单亲二体将会导致假排除，一般需要对同一号染色体上的多个基因座进行检测来证实。

5 STR基因座突变对亲子鉴定准确性影响试验

5.1 试验仪器与设备

3130型自动遗传分析仪、Identifiler plus试剂盒与9700型PCR扩增仪。

5.2 试验方法

①DNA提取与扩增。应用Identifiler plus试剂盒进行15个STR基因座的复合扩增处理，包括D8S1179、D2S1339、D21S11、D19S433、CSF1PO、D16S539、TH01、D3S1358、FGA、D18S51、TPOX与D2S1338。 控制整个反应体系为10μL，并按照亲子鉴定要求完成各项参数的设置：30℃条件小操作10min，41℃条件下处理30min，99℃下处理5min，5℃下处理5min，共进行35个循环处理，且最后的10min需要延长，调整温度为72℃。处理后得到的产物要置于4℃条件下保存。②检测扩增产物。应用Chelex-100提取模板BNA，并将处理得到的扩增产物经过3500DX基因分析仪完成毛细血管电泳。再利用全自动分析仪来确定亲权关系。

5.3 试验结果

用于本次试验的亲子鉴定标本共有3120份，支持亲子关系的有1946份，三联体806份，二联体1150份，合计观察到减数分裂共有1805次，15例基因座突变，突变率为0.83%。其中，突变率前三位基因分别是D8S1179、D21S11和D2S1339。可以确定STR在DNA合成过程中存在着比较高的突变率，造成基因突变，而对亲子鉴定结果的准确性产生影响。

6 结束语

STR基因座在亲子鉴定中存在着比较高的突变率，尤其是父方突变概率要高于母方。为降低突变对鉴定结果的影响，需要掌握STR基因座突变的规律，总结基因突变情况计算侵权指数，进一步提高亲子鉴定的准确性。