哮喘痰热郁肺证大鼠模型初建及评价

王浩，张露，王禹清，张庆祥

（山东中医药大学，山东 济南 250355）

哮喘是由多种炎症细胞及细胞组分介导的气道慢性炎症性疾病，以喘促、胸闷和（或）咳嗽为主要临床表现［1］。哮喘属“哮病”“喘证”的范畴［2］，其病机为痰阻气滞，肺失宣降。据统计［3］，我国有近3 000 万支气管哮喘患者，病死率为36.7/10 万，且儿童患哮喘人数逐年上升，急性发作时若得不到有效控制，往往会加重病情［4］。中医药治疗哮喘病具有明显优势，在急性发作期［5］、慢性持续期［6］及临床缓解期［7］均有较好的治疗作用，可以减轻发病症状，减少发病次数，提高生活质量。

随着社会发展，人们的饮食、生活习惯等方面发生变化，如喜食肥腻、多坐少动等，哮喘痰热郁肺证患者越来越多，但由于缺乏对应的动物模型，其相关机制尚未被完全阐明。中医证候模型研究起步晚、发展快，经历了从模仿西医构建病理模型，到根据中医理论构建中医病因模型，再到多因素复合制作病证结合动物模型的过程［8］。复合多因素制作病证结合动物模型是中医药理论指导结合现代医学理论与实验动物科学知识，以传统中医学病因复制证候动物模型，现代医学病因复制疾病动物模型，使模型动物同时具有疾病与证候特征［9］，是目前应用最多的造模方式。

本研究在哮喘大鼠模型构建［10］的基础上，依据“脾为生痰之源”“肥者令人内热”“肺与大肠相表里”等中医理论，分别施加诱导痰与热的因素，复合多因素建立哮喘痰热郁肺证大鼠模型，为进一步阐明哮喘的发病及中医药干预机制提供模型基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级雄性Wistar大鼠36只，体质量（150±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物使用许可证号：北京SCXK（京）2021－0011。实验大鼠饲养于山东中医药大学动物实验中心，动物房昼夜12 h光暗变替，相对湿度40%～60%，温度（23±2）℃，食水自由摄取。实验动物的使用与操作均符合山东中医药大学动物保护委员会（编号：SDUTCM20201204001）关于实验动物操作与动物福利的要求。

1.1.2 实验试剂、药品与仪器

4%多聚甲醛溶液；1%戊巴比妥钠溶液；卵清白蛋白（美国Sigma 公司，批号：A8040）；氢氧化铝（上海国药集团化学试剂有限公司，批号：20200226）；复方地芬诺酯片（常州康普药业有限公司，批号：1701023）；氯化乙酰胆碱（美国Solarbio 公司，批号：G8320）；电子体温计（OMRON，型号：MC－347）；压缩空气雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，型号：403K）；动物无创肺功能检测仪（美国Buxco，型号：FinePointe NAM）。

1.2 造模方法

将36只SPF级Wistar雄性大鼠按照随机数字表随机分为空白组、模型组、定喘汤组，每组各12只。各组大鼠造模前适应性饲养1周。

1.2.1 哮喘病模型制备

模型组、定喘汤组大鼠分别于造模第1、8、15 天给予腹腔内注射抗原液1 mL 致敏，其中每毫升抗原液含卵清白蛋白100 mg及氢氧化铝100 mg；第21天开始用1%卵清白蛋白雾化激发，30 min/次，2 次/d，连续14 d。空白组大鼠以等量生理盐水代替抗原液进行腹腔注射和雾化激发。

1.2.2 痰热郁肺证模型制备

从第1 天开始，每天予以高脂高糖低纤维饲料（北京科澳协力饲料有限公司，SCXK（京）2019－0003）喂养，并将自制脂肪乳（每500 mL 含猪油20 g，胆固醇10 g，猪胆盐2 g，吐温80 20 mL及1，2丙二醛20 mL）按照5 mL/kg加入造模大鼠日常饮水中。

从第16 天开始，使用复方地芬诺酯混悬液（15 mg/kg）灌胃，1 次/d，持续用药20 d 至实验结束；放入恒温鼓风箱［温度（37±2）℃，湿度35%～45%］施加风热刺激，30 min/次，每天2 次，持续干预20 d 至实验结束。

1.2.3 药物干预

从第22 天开始，定喘汤组予以定喘汤（2.0 g/kg）灌胃，持续用药14 d至实验结束。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 一般状态观察

观察3 组大鼠的精神状态、活动情况、呼吸状态、皮毛状态、二便情况；监测并记录体质量、体温、饮食量、饮水量情况。

1.3.2 大鼠肺功能测定

首先对动物无创肺功能检测仪进行密封校准，然后将清醒状态的大鼠放置于大鼠专用腔体内固定。通过橡胶膜分隔鼻部气流与胸部气流，打开通气避免大鼠窒息死亡。通过电脑操作，依次向雾化头内滴加PBS缓冲液以及12.5、25、50、100 mg/mL浓度的乙酰胆碱，观察并记录各项数据。

1.3.3 大鼠肺组织病理标本的制作

取4%多聚甲醛固定好的左肺上叶，进行常规HE染色切片，光镜下观察肺组织病理形态学改变。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般状态观察

空白组大鼠毛发柔顺，精神状态良好，体质量呈稳定增长趋势，呼吸节律均匀平稳，体温平稳，大小便正常；模型组大鼠毛发枯燥无光凌乱，精神状态差，喜卧少动，抓挠口、鼻频率高，呼吸声大，节律快，部分大鼠甚至可闻及哮鸣音，体温较高，口鼻处见黏性分泌物，二便量少，小便色黄；定喘汤组大鼠精神状态改善，活动较多，呼吸节律呈现平稳状态，体温降低，口、鼻处黏性分泌物减少，二便增多，小便淡黄。

2.2 各组大鼠体温变化情况比较

造模开始后，模型组和定喘汤组大鼠体温出现不同程度的升高，表明注射抗原液致敏效果良好，出现炎性发热现象。前3 周（第1～22 天）模型组和定喘汤组造模干预相同，故体温比较差异不大。自第22 天开始用药治疗后，与模型组比较，定喘汤组大鼠体温出现明显降低（P<0.05），表明定喘汤对于造模大鼠体温变化起到了调节作用。结果见表1和图1。

图1 各组大鼠不同时间点体温变化情况

表1 各组大鼠不同时间点体温变化情况比较（，℃）

表1 各组大鼠不同时间点体温变化情况比较（，℃）

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组大鼠肺功能情况比较

各组大鼠分别于取材前进行肺功能检测发现，大鼠特殊气道阻力随激发药物浓度升高而增大，其中模型组特殊气道阻力显著高于空白组，表明注射抗原液、雾化激发、风热环境等干预因素对肺组织造成了损伤，导致肺功能下降，特殊气道阻力增大。而定喘汤组特殊气道阻力低于模型组（P<0.05），表明使用定喘汤治疗后，大鼠肺功能有所恢复，特殊气道阻力下降。结果见表2。

表2 各组大鼠特殊气道阻力变化情况比较［，cm H2O/（L·s）］

表2 各组大鼠特殊气道阻力变化情况比较［，cm H2O/（L·s）］

注：与空白组比较，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，###P<0.001。

2.4 各组大鼠肺组织HE染色情况比较

通过大鼠肺组织病理形态学显示，正常组大鼠肺组织支气管上皮细胞排列紧密，可见少量细支气管上皮细胞脱落；纤毛排列较为整齐，未发现增生、肿胀、坏死和脱落等形态学改变；支气管周围未见明显的炎性细胞浸润。模型组大鼠肺组织可见大面积肺泡壁增厚，肺泡腔受挤压而塌陷，少量肺泡腔融合扩张，伴有淋巴细胞、粒细胞浸润；少量细支气管上皮细胞脱落，腔内可见嗜酸性物质，这一结果与哮喘病理形态学特点相符合。定喘汤组见肺泡壁增厚面积较少，有少量的淋巴细胞、粒细胞，见细支气管上皮细胞脱落，病理损伤程度较模型组减轻。结果见图2。

图2 各组大鼠肺组织HE染色图（×200）

3 讨论

3.1 模型评价

哮喘的主要特征包括气道炎症、气道重塑、可逆性气道阻塞和气道高反应性［11］。本研究通过病理切片观察肺组织病变情况，可见模型组大鼠出现大面积肺泡壁增厚，肺泡腔受挤压而塌陷，少量肺泡腔融合扩张，伴有淋巴细胞、粒细胞浸润；还有少量细支气管上皮细胞脱落，腔内可见嗜酸性物质；通过测定大鼠肺功能，可见模型组大鼠特殊气道阻力明显升高。结果表明，模型组大鼠肺功能情况和肺组织病理改变情况符合哮喘的主要特征。

哮喘痰热郁肺证是由外邪侵袭，郁而化热，与痰相互搏结，壅阻于肺所形成，因此常见咳嗽气喘、胸闷气短，痰液黏稠，咯吐黄痰甚或痰中带血，时有心烦、身热、汗出，舌红苔黄或黄腻，脉滑数，小便短涩［12］。本研究模型组大鼠出现体温升高，喜卧少动，毛发枯燥凌乱，呼吸加快及节律性收腹喘促，部分大鼠可闻及哮鸣音，舌红，口鼻处见黏性分泌物，二便量少，小便色黄，与临床痰热郁肺证表现相一致。

定喘汤出自明代张时彻的《摄生众妙方》，能宣降肺气、清热化痰平喘，是治疗哮喘常用方［13］。以定喘汤治疗造模大鼠，结果大鼠体温降低，舌淡红，口鼻处黏性分泌物减少，小便色淡黄；肺功能改善，特殊气道阻力降低；肺部病理改变好转，肺泡壁增厚面积减小，炎细胞浸润情况减轻。表明定喘汤在减轻发热，修复大鼠肺损伤，改善气道炎症和气道高反应性方面发挥重要作用。

综上，本研究通过复合多因素病证结合造模的方法，建立了符合临床病证特点的哮喘病痰热郁肺证大鼠模型，并从大鼠一般行为情况、微观指标、药物反证进行评价，表明模型构建成功，可为哮喘痰热郁肺证的深入研究提供依据。

3.2 痰热郁肺证造模思考

痰热证即痰与热邪相兼为病，临床上痰热郁肺证生成的常见内因是饮食不节或过食生冷、肥甘之物，伤及脾脏进而水谷精微不能正常运化，聚液成痰，痰郁日久化热；外因是机体感受风热之邪气，蕴于肺中蒸液成痰，痰郁于肺中而成痰热［14−15］。因此痰与热邪的诱导是建立模型的重要角度。

哮喘之夙根为体内之伏痰［16］，而如何诱导生痰便是动物造模的关键。根据《素问·奇病论》中“肥者令人内热，甘者令人中满”的论述，肥腻食物可使人阳气内郁而生热，甘味食物令人中气不行而胀满。若长期高脂高糖饮食可导致脾脏过劳而气虚，不能运化水谷、转输水液，聚湿成痰，即“脾为生痰之源”。故本实验以高脂高糖饲料和脂肪乳喂食大鼠，作为诱导痰、热生成的内因。同时，“肺为娇脏”清虚娇嫩，易受外邪侵袭，具有“易损”的特点［17］，过冷过热皆会使其受病。叶天士在《临证指南医案·肺痹》中指出：肺“凡六淫之气，一有所著，即能致病，其性恶寒恶热、恶燥恶湿，最畏火风。”故本实验中采用恒温鼓风箱给大鼠施加风热刺激，与饮食因素内外相合诱导证候，构建痰热郁肺证。同时饮食刺激所生之痰受热邪引动而发病，也会加重哮喘的症状，使动物模型病证表现更明显。

从传变方面，肺与大肠为相表里之脏腑，二者不仅在生理上互相联系，在病理上也会互相影响。《素问·咳论》曰：“肺咳不已，则大肠受之”阐述了肺病及肠的情况。有研究发现，慢性支气管炎的肺病动物模型，有胃内残留率升高，小肠推进率以及粪便含水率下降的情况［18］。同样，肠病也会影响到肺。《黄帝内经太素》曰：“邪客大肠及手阳明脉，大肠中热，大便难，肺气喘争”。有研究发现，腹膜炎大鼠出现了肺间质水肿、出血，部分肺泡塌陷、融合的情况［19］。基于此，本研究从相表里之脏腑在病理上会互相影响的角度入手，用复方地芬诺酯使大鼠出现“肠热腑实”的症状，进而影响肺，诱导肺内郁热之证候。

3.3 中医证候造模思考

中医证候模型构建从造模因素来看，可分为单因素造模和复合因素造模；从造模病因特点来看，可以分为西医疾病动物模型、证候动物模型以及病证结合动物模型［20］。本研究采用的是复合多因素［9］构建病证结合模型的方法，以药物诱导［21］出现明确、特异的病理效应，以多种病因因素诱导出中医证候表现。其中，证候造模时应以中医理论为依据，注重“证”与“病”相结合。另外，此模型构建过程中增加了相表里之脏腑病理上互相传变的角度，或可为中医证候模型的构建提供新思路。