下调miR-146a对牙髓炎模型大鼠的干预效果及作用机制

刘琳 张敏 息雪娜

(1哈励逊国际和平医院(衡水市人民医院)口腔科，河北 衡水 053000；2张家口学院)

牙髓炎的原因有很多，包括细菌感染、物理化学刺激和免疫反应，其中细菌感染是导致牙髓疾病的主要因素〔1〕。由于口腔不是无菌环境，所以当龋齿或外伤等疾病导致牙齿缺损没有及时治疗时，以细菌为基础的致病因素会通过牙齿缺损感染牙髓，从而导致牙髓炎〔2〕。牙髓炎的主要表现为牙痛，根据根管学的临床表现和治疗预后，可分为可逆性牙髓炎和不可还原性牙髓炎〔3〕。去除刺激因素并给予一定的治疗后，牙髓可以恢复到原来的状态，如果外界刺激持续，牙髓炎症将继续发展，最终发展为以自发性疼痛为标志症状的不可逆牙髓炎〔4〕。根据病程和疾病特点，不可复性牙髓炎又可分为急性牙髓炎、慢性牙髓炎、牙髓炎和逆行性牙髓炎〔5〕。本文皆在探讨下调miR-146a对牙髓炎模型大鼠的干预效果及作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 研究动物：采购于河南中医药大学(SYXK(豫)2020-0003)的SPF级SD大鼠共40只，6～9月龄，平均(7.50±1.20)月龄，体重250～315 g，平均(282.5±26)g，保持光照12 h/d，相对湿度24%～36%、温度(27.50±4.25)℃的环境内喂养大鼠1 w，本研究经医院伦理委员会审批通过。主要试剂：miR-146a(上海科敏生物科技有限公司)；白细胞介素(IL)-8酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海彩佑实业有限公司，货号：YS04529B)；肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，货号：SBJ-R0040)；IL-6 ELISA试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司，货号：LCS31109)；IL-1β ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，货号：SBJ-R0548)；Toll样受体(TLR)4一抗(上海优宁维生物科技股份有限公司，货号：MAB6248)；核因子(NF)-κB一抗(北京百奥莱博科技有限公司，货号：YT828-TUV)。

1.2慢病毒载体构建 miR-146a表达下调的慢病毒载体构建、大鼠miR-146a序列查找及设计由上海GeneChem公司完成，重组miR-146a上调病毒载体、miR-146a下调载体由上海GeneChem公司合成，并经测序验证，病毒滴度为108 TU/ml，制备完成将重组慢病毒载体在-80℃保存。

1.3分组及建模 将40只SPF级SD大鼠平均分为4组，每组10只，选择3组大鼠建立牙髓炎模型，参考韩耀伦等〔6〕研究实验进行构建：首先将3组大鼠进行麻醉，并采取仰卧位将其固定，用镊子使大鼠上颌张开，暴露其上颌磨牙，进行消毒后，将大鼠左侧上颌第一磨牙、第二磨牙用高速涡轮机005号球钻颌面开髓，髓孔大约1 mm，当观察到牙本质呈现红色后，使用金属探针加压形成穿髓孔开放髓腔，使髓腔充分暴露。观察牙髓血管扩张并伴随着充血现象，冠髓部白细胞大量浸润，表示建模成功。

1.4慢病毒转染 选取10只建模成功大鼠设为上调组，对其牙髓部注射含10 μl重组miR-146a上调病毒载体的慢病毒悬液；另选取10只建模成功大鼠设为下调组，对其牙髓部注射含10 μl miR-146a下调载体的慢病毒悬液；剩余建模成功的10只大鼠设为模型组，为进行建模处理的大鼠设为空白组，并对两组分别注射与上述两组等量的生理盐水。于2 w后观察各组大鼠的变化情况。

1.5miR-146a基因表达量 采集所有大鼠心脏血液，2 000 r/min 4℃离心10 min，收集血清。miRNA采用mirVana PARIS Kit试剂盒提取纯化。在室温下加入取出的500 μl血清样品等体积变性液，混合均匀，加入同样多的体积酸性酚氯仿，摇晃30～60 s；离心5 min 14 000 r/min在室温下操作。把上清液放到另一个管中，加入1.25倍无水乙醇充分混匀，然后加入柱中，离心30 s 12 000 r/min，弃滤液；700 μl加入柱中，清洗1次，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；把500 μl加入柱中，清洗2次，12 000 r/min离心1 min；95℃预热洗脱液60 μl加入柱子中，离心1 min 12 000 r/min，收集miRNA。miR-146a上游引物序列：5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，下游：5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′。U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，下游：5′-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3′。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底离心管中，37℃孵育1 h，加入0.1 ml样品稀释液。PCR扩增取上述0.02 ml DNA提取液加入分装好的反应液管中。

1.6病理组织学观察 各组腹腔注射3.0% 80 mg/kg的戊巴比妥麻醉，迅速取分离牙髓组织，将提取的牙髓组织制作成标本，用4%多聚甲醛固定，室温下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙、脱水后用石蜡进行包埋，作3 μm的切片，进行苏木素-伊红(HE)染色，使用光学显微镜观察海马神经病理变化。

1.7IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β水平检测 采集所有大鼠血样本，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，用移液枪吸取上清液，采用ELISA检测，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，将样品加入96孔酶标板中，每孔50 μl，随后将其样品加于至酶标板孔的底部位置，在进行加入的过程中对于孔壁尽量不要去触碰，加入之后进行摇匀，待摇匀后使用封板膜将其进行封板，置于37℃常温中进行孵育30 min。洗板3次，除去空白孔，其余的两孔内均分别加入50 μl的酶标试剂，37℃温育30 min。洗板3次，在3孔中按照先后顺序先加入50 μl的显色剂A，再加入50 μl的显色剂B，在37℃常温中进行温育30 min。每孔加入终止液50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。以空白孔凋零，450 nm波长依顺序测量各孔的吸光度，分析IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.8TLR4、NF-κB蛋白 采用Western印迹检测，取所有大鼠牙髓组织蛋白。对组织标本以磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗后，行30 min裂解，3 000 r/min离心处理10 min，提取上清液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量，在2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，添加完成蛋白缓冲液后开始进行100℃加热5 min。凝胶电泳、转膜，取膜，4℃下固定、封闭处理1 h，将一抗使用0.05%～0.10% TBST给予稀释，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为1 h，TBST连续洗膜3次，处理5 min。二氨基联苯胺(DAB)显色，定量分析蛋白表达情况。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0软件进行F检验、t检验。

2 结 果

2.1各组miR-146a表达、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达量比较 与空白组相比，模型组、上调组，下调组miR-146a基因表达量、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信号通路蛋白显著升高(P<0.01)；上调组miR-146a表达、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信号通路蛋白显著高于模型组(P<0.05)；下调组miR-146a表达、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信号通路蛋白显著低于模型组、上调组(均P<0.05)。见图1、表1。

表1 各组miR-146a表达、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信号蛋白表达比较

图1 Western印迹检测各组细胞TLR4/NF-κB信号通路蛋白

2.2病理学观察 空白组牙髓组织无明显变化。模型组穿髓点有坏死区出现，周围环绕少量纤维组织，且有大量炎症细胞浸润，根髓血管扩张、充血，出现大量红细胞。上调组冠髓被大量炎症细胞占据，大量成纤维细胞、牙本质细胞液化、体积变形，根髓空泡出现变形且排列紊乱。下调组牙髓组织内轻度炎症反应，在光镜下可以观察到穿髓点下方有少量中性粒细胞浸润，牙本质细胞排列紊乱，根髓正常，血管内有少量红细胞。见图2。

图2 各组牙髓炎病理观察(HE染色，×400)

3 讨 论

牙髓炎是临床常见病，疼痛是临床主要症状，且导致该病的因素较多，严重影响患者的身心健康〔7,8〕。此外，牙髓炎还会影响牙齿的血液循环、营养供应，而严重的牙髓炎还会引起牙髓坏死、根尖周炎，是牙齿脱落的重要原因〔9〕。牙髓炎的发展过程中，轻度炎症可引起牙髓组织自我再生、自我修复能力，重度炎症则会导致牙髓坏死〔10〕。

miRNA通过和靶基因mRNA 3′非转录区互相配对，从而引起mRNA的降解抑制，在转录后水平对基因的表达呈负调控。目前在人体内已发现530余种miRNAs，在疾病发生、发展中起到重要的作用。侯云华等〔11〕研究发现，慢性牙周炎(CP)患者在唾液中miR-146a表达水平的明显升高，miR-146a表达水平的高低与疾病严重程度具有相关性。目前尚未有研究miR-146a在牙髓炎的机制作用，所以牙髓炎后miR-146a是否参与调控其炎症反应及其主要的靶基因都不明确〔12,13〕。本研究结果表明，miR-146a可能与牙髓炎症反应相关，且可能在牙髓炎恢复过程中对炎症反应的调控发挥重要的作用。

TNF-α对于机体内部的肿瘤细胞有明显杀伤力，但是对于正常细胞不具备杀伤作用，其广泛存在于机体中，在机体炎症反应中较为活跃，可作为各种信号通路的关键环节〔14,15〕。IL-1β广泛参与炎症反应中，研究证明在发生牙髓炎时IL-1β水平明显升高，并且参与了牙髓炎的免疫反应〔16〕。IL-6具有多生物学活性的特征。其在机体中的高表达可以促进细胞的分化和浸润，上调其他炎性细胞因子的表达，加重炎症损伤和神经根超敏，最终导致疼痛、麻木等相关症状〔17,18〕。有研究表明，炎性因子能够通过调控牙髓细胞的炎症反应，参与牙髓炎的整个过程。有研究显示，IL-8和IL-6水平明显高于正常牙髓炎患者。IL-8 在炎症前期发挥调节作用，炎症前期IL-8就会起到调节影响，炎症受损位置IL-8了募集中性粒细胞对炎症反应起到介导作用，在促炎阶段IL-8是第二大细胞因子〔19,20〕。本研究结果说明，下调miR-146a可有效降低炎症反应，起到保护牙髓细胞的作用。TLR4/NF-κB信号在细胞的氧化应激、炎性反应等生理病理过程中起到重要的作用〔21〕。NF-κB活化后不仅可以调节免疫反应中的基因，还可以转录上调炎症相关基因的表达。NF-κB可以激活各种外界刺激，包括血流切应力。TLR4是哺乳动物的Toll样受体。有研究显示，TLRs家族不仅在免疫应答中发挥重要作用，而且与各种炎症性疾病密切相关。本研究发现miR-146a对牙髓炎具有良好的抑制效果，其原因可能为miR-146a通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的方式抑制机体炎症反应，从而达到对牙髓炎的抑制效果，更好的保护牙髓细胞不受侵害。

综上，下调miR-146a基因可能经作用于TLR4/NF-κB信号通路后，抑制炎症反应，miR-146a可以成为牙髓炎诊断和病情判断的分子标志物。