miR-34a对膀胱尿路上皮癌细胞Beclin1介导的自噬及吉西他滨化疗敏感性的影响

杨涛 王刚 孙福振 李守宾 郭留雄 邓新娜 刘俊江

(河北省人民医院 1泌尿外科，河北 石家庄 050000；2肿瘤四科)

膀胱癌的病理类型主要包括膀胱尿路上皮癌、膀胱癌和膀胱鳞状细胞癌。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最常见的病理类型，以前称为膀胱移行细胞癌，占膀胱癌患者总数的90%以上〔1〕，其特点为发展迅速、复发率高，患者5年生存率仅为6%且预后极差〔2〕。微小RNA(miRNA)是一类长度为20～25 nt，具有基因调控功能的小分子非编码RNA，其中，过表达miR-34a可提高胃癌对抗癌药物的敏感性〔3〕。而过表达miR-34a还能够抑制癌细胞生长，前人研究发现，降低miR-34a表达水平可以促进膀胱癌细胞的增殖〔4〕。自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，在机体生理和病理过程中常见〔5〕，其发挥的正负面作用尚不完全清楚。但是，有研究发现，自噬是耐化疗的重要机制，可帮助肿瘤细胞克服紫杉醇等化疗药物引起的代谢应激，保护肿瘤细胞存活并产生耐药〔6〕。而肿瘤抑制因子可以通过抑制自噬，提高膀胱癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性〔7〕。但是，目前miR-34a对膀胱尿路上皮癌细胞J82中Beclin1介导的自噬及吉西他滨化疗敏感性的影响尚未见报道。本研究通过使用前期构建的J82耐吉西他滨细胞株(J82/Gem)，并转染miR-34a模拟物，研究过表达miR-34a对J82/Gem自噬及化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株和药物 膀胱尿路上皮癌细胞株J82购自美国Sciencell公司；吉西他滨(规格：0.2 g×8瓶)购自江苏豪森药业集团有限公司。

1.1.2主要试剂及仪器 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基购自美国Giboc公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；细胞自噬染色检测试剂盒〔单丹磺酰尸胺(MDC)染色法〕购自索莱宝生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自美国Genecopoeia公司；miR-34a NC(miR-34a阴性对照)、miR-34a模拟物(miR-34a mimics)及miR-34a和U6引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸钠(SDS)和β-actin鼠抗均购自美国Sigma公司；蛋白提取试剂盒、电化学发光(ECL)显色试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒、Beclin1、微管相关蛋白轻链(LC)3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62鼠抗和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗均购自美国Abcam公司；酶标仪Fax-20100购自美国INStat公司；尼康SMZ745光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式细胞仪购自美国Beckman公司；TL988 qRT-PCR仪购自西安天隆科技有限公司；全能型凝胶成像分析系统ChemiDoc-MP购自山东三瑞科技有限公司；转膜仪和电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2细胞培养与分组 J82细胞使用含有10% FBS DMEM/F12培养基，在37℃含5% CO2的恒温培养箱中培养。本研究前期通过吉西他滨诱导建立J82/Gem细胞系(J82耐吉西他滨细胞系)，为维持耐药表型，用0.5 μg/ml的吉西他滨培养J82/Gem细胞。并将J82/Gem细胞分别转染miR-34a NC(miR-34a NC组)和miR-34a mimics(miR-34a mimics组)，转染24 h，另取未转染J82/Gem细胞(J82/Gem组)和J82细胞(J82组)，均使用含0.5 μg/ml的吉西他滨培养24 h后，检测其增殖、凋亡和自噬。

1.3qRT-PCR检测各组细胞中miR-34a表达水平 采用RNA抽提试剂盒提取各组细胞总RNA，反转录得到cDNA置于-20℃冰箱保存待用。采用qRT-PCR法扩增miR-34a目的片段。反应体系和反应条件参照qRT-PCR试剂盒说明书。以U6为内参，采用2-ΔΔCt计算细胞中miR-34a相对表达水平。miR-34a及其内参U6引物序列：miR-34a：上游5′-CAACAGAAGGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTTCTTTC-3′、下游5′-ATTCTGATCAGGATCCTGGAGCTCACTTTC-CCAG-3′；U6:上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4CCK-8法检测各组细胞增殖活性及吉西他滨敏感性 收集培养24 h后的各组细胞，每孔100 μl接种至96孔板中，加入浓度为10%的CCK-8溶液，继续培养2 h后，于酶标仪上测定各孔在450 nm波长下的OD值，OD值越大表明其增殖活性越高。

取对数生长期的各组细胞，调整细胞浓度为5×104个/ml，每孔100 μl接种至96孔板中，置于37℃，含5% CO2的细胞培养箱中培养4～6 h至细胞贴壁生长，分别加入终浓度为0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/ml的吉西他滨处理24 h后，检测细胞增殖活性，然后根据剂量-反应曲线计算吉西他滨的半数抑制浓度(IC50)。

1.5流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 收集培养24 h后的各组细胞，1 200 r/min离心5 min，弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入400 μl结合缓冲液悬浮细胞，再加入5 μl膜联蛋白(Annexin)V染液，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15 min；然后加入10 μl碘化丙啶(PI)轻轻混匀，于2～8℃避光继续孵育5 min后，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.6MDC染色观察各组细胞自噬小体 收集培养24 h后的各组细胞，使用PBS洗涤2遍，取1 ml PBS重悬细胞，加入1 μl浓度为50 mmol/L的MDC工作液，使MDC终浓度为0.05 mmol/L，37℃避光孵育30 min后，PBS再次洗涤3遍，吸取微量少量细胞悬液与载玻片上，盖上盖玻片，使用荧光显微镜观察各组细胞自噬小体，并计算MDC阳性细胞率。

1.7Western印迹检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平 收集培养24 h后的各组细胞，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，然后依次进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、转PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭、1∶2 000浓度稀释后的Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、β-actin鼠抗4℃过夜孵育、含辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶5 000)中室温孵育2 h，用ECL显色试剂盒显色，以β-actin内参，全能型凝胶成像分析系统分析蛋白表达水平。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1过表达miR-34a对J82/Gem细胞增殖活性及吉西他滨IC50值的影响 与J82组相比，J82/Gem组和miR-34a NC组细胞miR-34a表达水平降低，增殖活性和吉西他滨IC50值升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与miR-34a NC组相比，miR-34a mimics组细胞miR-34a表达水平升高，增殖活性和吉西他滨IC50值降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞miR-34a表达水平、增殖活性及吉西他滨IC50值比较

2.2过表达miR-34a对J82/Gem细胞凋亡率影响 与J82组〔(72.33±7.48)%〕相比，J82/Gem组和miR-34a NC组细胞凋亡率降低，差异具有统计学意义〔(14.58±1.83)%、(12.27±1.45)%，P<0.05〕；与miR-34a NC组相比，miR-34a mimics组细胞凋亡率升高，差异具有统计学意义〔(76.08±7.96)%,P<0.05〕。见图1。

图1 各组细胞凋亡

2.3过表达miR-34a对J82/Gem细胞自噬率的影响 与J82组〔(19.23±2.14)%〕相比，J82/Gem组和miR-34a NC组细胞自噬率升高，差异具有统计学意义〔(56.37±5.89)%、(58.65±5.90)%，P<0.05〕；与miR-34a NC组相比，miR-34a mimics组细胞自噬率降低，差异具有统计学意义〔(16.24±5.90)%,P<0.05〕。见图2。

箭头所示为MDC染色阳性细胞图2 各组细胞自噬小体荧光显微镜观察(×400)

2.4过表达miR-34a对各组细胞自噬相关蛋白表达水平的影响 与J82组相比，J82/Gem组和miR-34a NC组细胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高，p62蛋白表达水平降低，差异均具有统计学意义(均P<0.05)；与miR-34a NC组相比，miR-34a mimics组细胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低，p62蛋白表达水平升高，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组细胞中Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达水平比较

图3 Western印迹检测各组细胞自噬相关蛋白表达

3 讨 论

膀胱尿路上皮癌是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤，其生物学行为复杂，进展快，易复发，化疗是常规手术后治疗局部疾病的有效方法，然而患者易对化疗药物产生抵抗，是临床治疗失败的主要原因〔8〕。吉西他滨是临床上联合顺铂化疗膀胱癌的主要药物，癌细胞对吉西他滨耐受性的出现，严重影响其治疗效果〔9〕，所以，提高膀胱尿路上皮癌细胞对吉西他滨的敏感性是当下研究的热点。本研究结果提示，J82对吉西他滨化疗敏感性的作用机制与miR-34a密切相关，但尚需进一步研究。

自噬是一个严格调控的分解代谢过程，抑制自噬可能使肿瘤细胞对常见药物敏感，或克服这些细胞对化疗药物的耐药性〔10〕。Zeng等〔11〕研究发现抑制自噬使可膀胱尿路上皮细胞癌对紫杉醇敏感，Sun等〔12〕研究发现抑制自噬可增强非小细胞肺癌的化疗敏感性。但是，关于自噬与细胞及疾病关系一直是争论的焦点，细胞自噬是把双刃剑，细胞既可通过提高自噬减少细胞坏死，减轻有毒物质的积累，又可通过主动降低自身自噬活性，减少因自噬引起的细胞死亡〔13〕。而自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达水平可反映自噬程度，自噬溶酶体降解底物p62表达的增加与自噬水平呈反相关〔14〕。本研究结果表明，J82/Gem细胞中自噬水平较高，提示抑制J82/Gem细胞中自噬可能提高其化疗敏感性。

miR-34a不但参与癌症发病机制的多种细胞和分子途径，在肿瘤发生和化疗耐药中发挥重要作用〔15〕，而且还在癌症干细胞参与的人尿路上皮性膀胱癌耐药和复发过程中发挥关键作用〔16〕。Zhang等〔17〕研究发现miR-34a在体内外均可增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。Li等〔18〕研究发现miR-34a通过上调相关信号通路信号，提高体外骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。Liu等〔19〕研究发现miR-34a通过靶向HMGB1基因，在急性髓系白血病细胞中促进细胞凋亡和抑制自噬。本研究结果表明，过表达miR-34a可抑制J82/Gem细胞自噬及自噬相关蛋白表达，提高J82/Gem细胞对吉西他滨的敏感性。有研究指出，miR-34a可通过抑制自噬，降低结肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性〔20〕。提示miR-34a可能通过抑制自噬，提高J82/Gem细胞对吉西他滨的敏感性。

综上，miR-34a可能通过抑制Beclin1介导的自噬，提高膀胱尿路上皮癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性，但其中的机制较为复杂，尚需深入研究。