ROS调控细胞自噬在UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡中的作用

刘汝兰，毛汉潇，何渊民，谭自敏，熊霞，谭小琦

长波紫外线(ultraviolet A, UVA)是诱发多形性日光疹、慢性光化性皮炎、皮肤基底细胞癌等多种皮肤疾病的重要原因[1]。既往研究发现UVA照射皮肤后可以引起表皮细胞和真皮细胞的一系列复杂反应。有学者[2-4]已经发现UVA可以通过上调胞内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等诱导成纤维细胞凋亡，但具体环节及调控机制尚不完全清楚。细胞自噬是真核生物细胞一种保守的自我降解方式，对实现细胞代谢、更新细胞成分、维持细胞内环境稳态有重要的意义。细胞自噬可以抑制细胞凋亡，促进细胞存活；也有研究表明细胞自噬也可以导致细胞凋亡[5]。目前细胞自噬在UVA诱导人真皮成纤维细胞凋亡过程中的作用尚不清楚，ROS与自噬之间的相互作用机制也未厘清。因此，本研究拟明确UVA诱导人皮肤成纤维细胞凋亡中细胞自噬及胞内ROS的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料 人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts, HDF)：来自健康男性包皮环切术时的包皮组织。主要试剂：胎牛血清购于巴西Bovogen公司；50 μmol/L3-甲基嘌呤(3-MA)、100 nmol/L雷帕霉素(RAPA)购于中国MCE公司；高糖DMEM、GlutaMAX、NEAA、0.25%胰酶购于美国Gibco公司；DMSO 购于中国碧云天生物技术公司；FITC Annexin V /PI Apoptosis Detection Kit购于美国BD公司；兔抗人p62多克隆抗体及兔抗人LC3多克隆抗体购于美国CST公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 取健康男性包皮环切术时的包皮，参照文献[6]分离培养HDF，培养至第3代冻存，根据实验进程需求对HDF解冻复苏，培养细胞至第6～8代用于实验。

1.2.2建立不同剂量UVA照射人皮肤成纤维细胞的模型 显微镜下观察到人皮肤成纤维细胞培养至重悬细胞。调节重悬液的细胞密度约为1.5×105个/mL，均匀接种于6孔板中。待细胞铺满板底约80%时，6孔板尽快转移至紫外线模拟器行UVA照射处理，照射结束后立即返回细胞培养工作台，置于孵箱中继续培养4 h。本实验小组通过前期探索已成功构建出UVA诱导人皮肤成纤维细胞凋亡的适宜模型。设置阶梯性变化不同的UVA照射剂量和照射后继续培养时间，通过检测细胞形态学变化、细胞活性和细胞凋亡，发现UVA剂量增加至8 J/cm2时可同时满足细胞凋亡率增加且细胞活性和细胞状态良好。就继续培养时间而言，当光照后继续培养4 h时，细胞形态变化最大，4 h后形态趋于稳定不变。故最终确定最佳照射剂量和时间，即细胞经8 J/cm2UVA照射后继续培养4 h，为后续实验提供依据。

1.2.3细胞生长状态检测 细胞随机分为对照组、UVA组、雷帕霉素(RAPA)组和3-甲基嘌呤(3-MA)组。RAPA组和3-MA组分别加入稀释后的母液100 nmol/L和50 μmmol/L。除对照组外，其余各组以不同试剂预处理2 h后按UVA造模步骤用紫外线模拟器以8 J/cm2的UVA进行照光处理。继续培养4 h后，在倒置相差显微镜下观察RAPA组、3-MA组、UVA组和对照组的成纤维细胞生长状态情况，并拍照做好记录。

1.2.4细胞增殖活性检测 加入MTT和DMSO在全自动酶标仪波长490 nm下测定各孔吸光度(OD值)。

1.2.5细胞凋亡率检测 加入Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI后在流式细胞仪上检测经过处理后细胞凋亡情况。

1.2.6Western blot检测 细胞按步骤接种于6孔板中。按实验目的和实验分组不同，分别予不同条件干预。干预后分别检测p62、LC3蛋白的表达水平。

2 结果

2.1UVA照射对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响 结果显示：对照组(未予以UVA照射)、4、8、12、16 J/cm2组细胞凋亡的百分率分别为(5.22±0.4)%、(6.91±0.37)%、(14.43±3.01)%、(27.93±1.35)%和(32.12±1.65)%。除对照组与4 J/cm2组差异无统计学意义(P>0.05)，其余各组之间差异均有统计学意义 (F=106.61，P<0.01)。与对照组相比，当照射剂量≥8 J/cm2，随着UVA剂量的增加，人皮肤成纤维细胞的增殖活性显著下降，细胞凋亡率显著增加，见图1。随着UVA剂量的增大，胞内颗粒增多，细胞碎裂更多，细胞回缩变圆，突起变短，细胞排列间隙增大，胞质折光性下降；当UVA的剂量为8 J/cm2时，细胞增殖活性>85%且细胞状态良好；当UVA的剂量<8 J/cm2，细胞形态及数量变化不明显；40 J/cm2已经完全看不清细胞轮廓。成纤维细胞经8 J/cm2UVA照射后继续培养4 h后的细胞形态变化较大；4 h之后，细胞维持一定形态，本实验不同剂量UVA照射后继续培养4 h后观察相关指标，见图2。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The apoptosis of fibroblasts was detected by flow cytometry;The activity of each group of fibroblasts by MTT assay; Comparison of fibroblasts apoptosis rate group图1 UVA照射对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响Fig.1 The effect of UVA irradiation on human fibroblasts apoptosis

2.2UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡中细胞自噬的作用 采用RAPA、3-MA分别孵育细胞2 h，进行8 J/cm2UVA照射后继续培养4 h。4 h后在倒置相差显微镜下观察到：RAPA组和UVA组细胞轮廓清晰，RAPA组细胞排列较UVA组更紧密，呈火焰状，细胞形态变化不明显，UVA组漂浮细胞较RAPA组多。3-MA组细胞内颗粒增多，漂浮细胞较UVA组多。细胞活性从高到低的顺序依次是对照组、RAPA组、UVA组、3-MA组，组间比较差异有统计学意义(F=23.86，P<0.01)。细胞凋亡率从高到低的顺序依次是3-MA组(20.45±2.14)%、UVA组(15.42±0.77)%、RAPA组(8.62±1.12)%、对照组(5.39±0.74)%，各组之间比较差异有统计学意义(F=83.356，P<0.01)，见图3～4。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The apoptosis of fibroblasts was detected by flow cytometry; The activity of HSF by MTT assay; Comparison of fibroblasts apoptosis rate图3 UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡中细胞自噬的作用Fig.3 The role of autophagy in UVA-induced human fibroblasts apoptosis

Control; UVA; RAPA; 3-MA图4 改变自噬水平后成纤维细胞形态学的观察 (×200)Fig.4 After UVA irradiation, the morphology of fibroblasts in control group,UVA group,RAPA group and 3-MA group (×200)

2.3UVA照射后人皮肤成纤维细胞内ROS水平变化 细胞经8 J/cm2UVA照射后分别于1、2、3、4 h用流式细胞术检测胞内ROS水平。与未经光照组(即0 h组)相比，光照后继续培养1 h检测到的胞内ROS水平变化差异无统计学意义(P=0.152)，2、3、4 h组的胞内ROS水平均升高，各组之间比较差异有统计学意义(F=54.724，P<0.01)。且细胞在4 h内随着继续孵育时间的延长，ROS水平逐渐升高，见图5。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.～ The level of ROS in fibroblasts was detected by flow cytometry; Changes of ROS level in fibroblasts at different time points after UVA irradiation图5 UVA诱导人皮肤成纤维细胞内ROS水平的变化Fig.5 UVA-induced changes of intracellular ROS in fibroblasts

2.4UVA照射人皮肤成纤维细胞后ROS对细胞自噬的调控作用 Western blot检测对照组、UVA组和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理组的LC3和p62的表达情况，结果显示：LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62在三组中的相对表达量差异有统计学意义(F=260.976、1 922.181，P<0.01)。与对照组相比，细胞经UVA照射后LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高，p62表达降低。给予5 mmol/L抗氧化剂NAC预处理组的胞内LC3Ⅱ/Ⅰ比值虽较对照组高，但低于UVA处理组，且其p62的表达虽低于对照组但高于UVA处理组，见图6。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The expression of p62 and LC3 in fibroblasts after different treatments;The expression of intracellular LC3Ⅱ/Ⅰ differences after different treatments; The expression of intracellular p62 differences after different treatments图6 氧化应激对人皮肤成纤维细胞自噬的影响Fig.6 The effect of oxidative stress on human fibroblasts autophagy

3 讨论

UVA照射可深达皮肤真皮层，给位于真皮层的成纤维细胞造成不同程度的损伤并可诱发细胞的自我防御与修复[7]。细胞自噬是真核生物细胞内一种关键的自我防御与修复过程。研究UVA对成纤维细胞凋亡和自噬的调节对减缓成纤维细胞的光损伤甚至逆转细胞结局有重要价值。在本研究中，笔者发现不同剂量UVA照射人皮肤成纤维细胞后，随着UVA剂量的增加，对人皮肤成纤维细胞的损伤呈时间依赖性加重，UVA照射成纤维细胞后4 h的细胞形态变化较大，4 h之后，细胞却维持一定形态。既往有研究[8]发现UVA诱导成纤维细胞凋亡是通过下调Bcl-2的表达和损伤DNA来实现的，此过程主要发生在紫外线照射后的4 h内[2]。Godar[9]将紫外线诱导细胞凋亡的机制分为立即或延迟，发现UVA致细胞凋亡为立即凋亡，UVB引起的是延迟凋亡。本课题在研究UVA致成纤维细胞凋亡的过程中，发现细胞形态变化明显的时间也是4 h，选择UVA处理后的时间和以往研究发现的UVA致细胞凋亡时间一致。

细胞自噬对细胞存在的“双面效应”[10]。正常情况下细胞自噬维持在低水平，当胞外营养成分变化[11]、缺血缺氧[12]、生长因子浓度变化和胞内出现代谢压力、细胞器损害和蛋白质折叠错误等情况时，自噬水平被上调以完成对错误的修正和适应环境的变化。当损伤超出细胞修正范围时细胞自噬则对细胞起到促凋亡作用。在本研究中，从细胞形态学及凋亡检测结果中，笔者发现RAPA组细胞排列较UVA组更紧密，呈火焰状，细胞形态变化不明显，UVA组漂浮细胞较RAPA组多。3-MA组细胞皱缩变圆，细胞间隙增宽，细胞折光性降低，漂浮细胞较UVA组多。UVA照射人皮肤成纤维细胞后细胞的凋亡率，RAPA组低，UVA组次之，3-MA组最高。由此可见，采用RAPA诱导细胞自噬水平上调可抑制UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡。

研究发现，细胞自噬过程与胞内氧化应激之间关系十分密切。一方面，氧化应激是影响细胞自噬的重要因素。许多条件比如饥饿处理[13]或者细胞外营养物质(如葡萄糖、谷氨酰胺、丙氨酸和血清等)被剥夺[11]诱导的ROS升高可以上调细胞自噬水平[14-15]。另一方面，细胞自噬通过直接清除体内的受损线粒体并恢复部分抗氧化酶活性，或者通过间接调控多条抗氧化信号通路来降低胞内氧化水平。如Kim等[16]研究发现瑞芬太尼可通过上调细胞自噬来减少过氧化氢诱导的角质形成细胞的氧化损害。尽管众多研究[17-19]证实抗氧化剂的预处理的确可降低由刺激因子引起的细胞自噬，细胞自噬也通过去除氧化损伤分子和受损细胞器等途径来降低细胞毒性[20]，但氧化应激与自噬之间的相互作用机制仍需进一步完善。本研究发现成纤维细胞经UVA照射后，细胞内ROS的水平增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大，p62表达降低。给予5 mmol/L 抗氧化剂NAC处理成纤维细胞后，可显著降低LC3Ⅱ/Ⅰ比值，增加p62的表达。LC3Ⅱ/Ⅰ的比值变化及p62的表达情况常用以评估细胞自噬水平的变化，表明细胞内ROS水平的上调可促进细胞自噬产生。综上所述，本研究发现UVA照射人皮肤成纤维细胞可以促进细胞凋亡，同时UVA照射可以通过上调细胞内ROS水平诱导细胞自噬的产生，从而发挥其抗凋亡效应。