阿尔茨海默病患者血清miR-98-5p和miR-142-5p水平变化及其意义

何霞，卫仙洪，李佳，李玲，王建

1 雅安市人民医院检验科，四川雅安 625000；2 雅安市人民医院神经内科

阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的神经退行性疾病，是导致老年人失能的重要原因［1］。大多数学者认为，脑内大量β 淀粉样蛋白（Aβ）沉积使小胶质细胞活化从而引起慢性神经炎症，可能是AD发病的重要病理生理机制［2］。因此，抑制神经炎症有可能成为防治AD的一个新途径。微小RNA（miRNA）是一类非编码RNA 分子，在生物体中可参与转录后的基因表达调控。近年研究表明，miRNA 在AD 的发生、发展中发挥重要作用［3］。miR-98-5p、miR-142-5p 是新近发现的miRNA分子。有研究报道，miR-98-5p在缺血性脑卒中患者脑组织中异常富集，并与神经炎症密切相关［4］；而miR-142-5p与多发性硬化症患者神经炎症密切相关［5］。有研究通过分析AD 患者血液中miRNA表达谱发现，AD 患者血液中miR-98-5p、miR-142-5p水平显著升高［6-7］。本研究探讨了AD 患者血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年1月—2022年1月雅安市人民医院收治的AD 患者103 例（观察组）。AD诊断依据《2018 中国痴呆与认知障碍诊治指南（二）：阿尔茨海默病诊治指南》［8］。纳入标准：①符合AD 诊断标准；②初诊，入院前未接受任何AD 相关的治疗；③临床资料完整。排除标准：①近3个月内有急慢性感染者；②有攻击行为或自杀倾向者；③合并心、肝、肾等重要脏器严重功能不全者；④合并免疫系统或造血系统损害者；⑤合并颅脑损伤导致的认知功能障碍者；⑥合并严重躯体疾病或精神疾病者。其中，男63 例、女40 例，年龄53～87（66.54 ±5.87）岁，BMI 18.7～28.3（22.54 ± 1.98）kg/m2，文化程度：高中及以上49 例、初中及以下54 例。同期另选体检健康的志愿者50 例（对照组），男31 例、女19 例，年龄32～82（65.18 ± 5.52）岁，BMI 19.7～27.4（22.18 ± 1.55）kg/m2，文化程度：高中及以上24 例、初中及以下26 例。两组性别、年龄、BMI、文化程度具有可比性。本研究经雅安市人民医院伦理委员会批准（审批文号：AW2214），所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 血清miR-98-5p、miR-142-5p 检测 观察组入院次日，对照组体检当日，采集空腹外周静脉血3 mL，3 000 r/min离心15 min、离心半径10 cm，取上层血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol 法提取血清总RNA，经微量分光光度计鉴定，提取的总RNA 纯度和浓度合格。按逆转录试剂盒说明将总RNA 逆转录为cDNA。逆转录条件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA 为模板，按SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行PCR 扩增。所有引物序列由新贝（上海）生物科技有限公司设计合成。miR-98-5p 上游引物5'-TGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTT-3'、下游引物5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'，miR-142-5p上游引物5'-AACCAAGACGCTCATGAAGAAG-3'、下游引物5'-CTGCGAGTAGGACATGCTGTAG-3'，内参U6 上游引物5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'、下游引物5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。PCR反应体系共20 μL：SYBR®Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL、50×ROX Ref⁃erence Dye 0.4 μL，RNase Free H2O 6 μL；反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s 共40 个循环。PCR扩增反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值（CT）数。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT法计算血清miR-98-5p、miR-142-5p水平。

1.3 血清Aβ1-40、Aβ1-42检测 观察组入院次日、对照组体检当日，采集空腹外周静脉血3 mL，3 000 r/min离心15 min、离心半径10 cm，取上层血清，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 法检测血清Aβ1-40、Aβ1-42。试剂盒购自优利科（上海）生命科学有限公司。所有操作严格按试剂盒说明进行。

1.4 认知功能评估 观察组入院次日，对照组体检当日，采用简易精神状态检查量表（MMSE）评分评估认知功能。MMSE 包括6 个维度30 个条目，总分0～30分。MMSE评分越高，认知功能越好。

1.5 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。正态分布的计量资料以±s表示，结果比较采用独立样本t检验；偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，结果比较采用U检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 或Spearman 相关分析法。诊断效能分析采用受试者工作特征（ROC）曲线，曲线下面积（AUC）比较采用Hanley & McNeil 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-98-5p、miR-142-5p水平比较 见表1。

表1 两组血清miR-98-5p、miR-142-5p水平比较

2.2 两组血清Aβ1-40、Aβ1-42 水平和MMSE 评分比较 见表2。

表2 两组血清Aβ1-40、Aβ1-42水平和MMSE评分比较

2.3 AD 患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平与血清β1-40、Aβ1-42水平和MMSE评分的关系 Pearson/Spearman 相关分析显示，AD 患者血清miR-98-5p 水平与血清Aβ1-40 水平呈正相关关系（r=0.594，P＜0.05），与血清Aβ1-42 水平和MMSE 评分均呈负相关关系（r分别为-0.517、-0.618，P均＜0.05）；血清miR-142-5p 水平与血清Aβ1-40 水平呈正相关关系（r=0.562，P＜0.05），与血清Aβ1-42 水平和MMSE 评分均呈负相关关系（r分别为-0.574、-0.624，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-98-5p、miR-142-5p水平对AD的诊断价值 ROC 曲线分析显示，血清miR-98-5p 水平诊断AD 的AUC为0.782（95%CI：0.709～0.845），其最佳截断值为1.36，此时其诊断AD 的灵敏度为61.17%、特异度为94.00%；血清miR-142-5p水平诊断AD 的AUC为0.791（95%CI：0.718～0.852），其最佳截断值为2.23，此时其诊断AD 的灵敏度为61.17%、特异度为92.00%；血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平联合诊断AD 的AUC为0.887（95%CI：0.826～0.932），其诊断AD的灵敏度为77.67%、特异度为92.00%。血清miR-98-5p、miR-142-5p水平联合诊断AD的AUC大于血清miR-98-5p、miR-142-5p水平单独（Z分别为3.409、3.661，P均＜0.05）。见图1。

图1 血清miR-98-5p、miR-142-5p水平诊断AD的ROC曲线

3 讨论

AD是老年人最常见的一种痴呆类型。据调查，2020年我国60岁以上人群中痴呆患者约有1 507万例，其中AD 患者983 万例［9］。尽管近年来全球研发出了多种AD 治疗药物，但迄今为止仍无特效药物能够延缓AD 病情进展，故早发现、早干预至关重要。在临床上，AD的诊断较为复杂，包括病史采集、体格检查、神经心理评估、影像学检查等。但《2020中国阿尔茨海默病患者诊疗现状调研报告》指出，我国55.83% AD患者在出现症状7个月以上才得以确诊［10］。因此，亟需寻找新的早期诊断手段。

AD最主要的病理特征为Aβ沉积引起的神经炎症、突触丢失或功能障碍、氧化应激、神经原纤维缠结等。其中，Aβ 沉积引起的小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元等炎症反应可能是AD 发病的重要病理生理机制［2］。Aβ是含有39～43个氨基酸的多肽。人体内Aβ 常见的亚型为Aβ1-40、Aβ1-42。有研究报道，血液中Aβ1-40 水平降低和Aβ1-42 水平升高能够反映AD 患者脑内Aβ 沉积情况［11］。本研究结果显示，观察组血清Aβ1-40 水平降低、血清Aβ1-42水平升高，符合AD患者Aβ沉积这一病理变化。

miRNA 是一类非编码RNA 分子，在生物体中可参与转录后的基因表达调控。近年研究表明，miRNA在AD 的发生、发展中发挥重要作用［3］。miR-98-5p、miR-142-5p 是新近发现的miRNA 分子。miR-98-5p基因定位于人染色体Xp11.22。ZHENG 等［12］研究报道，miR-98-5p 能够靶向调控Toll 样受体4/NF-κB信号通路参与内皮细胞炎症。巫兴阳等［13］研究报道，miR-98-5p与脓毒症全身炎症反应激活有关。结果表明，miR-98-5p 是一个与炎症反应密切相关的miRNA。ZHOU 等［4］研究报道，miR-98-5p 在缺血性脑卒中患者脑组织中异常富集，并与神经炎症密切相关。miR-142-5p基因定位于人17号染色体。既往研究报道，miR-142-5p是一个与肿瘤相关的miRNA。近年研究发现，miR-142-5p 还能参与炎症反应。XU等［14］研究报道，miR-142-5p 能够靶向细胞因子信号抑制剂1 激活NF-κB 信号通路，促进肝脏炎症反应。在帕金森病模型中，抑制miR-142-5p能够抑制NF-κB信号通路激活，进而抑制神经元炎症［15］。结果表明，miR-142-5p也是一个与炎症反应密切相关的miRNA，能够参与神经炎症反应。

本研究结果发现，观察组血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平显著高于对照组，与以往研究［6-7］报道一致。进一步分析发现，AD患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平与血清Aβ1-40水平均呈正相关关系，与血清Aβ1-42水平均呈负相关关系。提示AD患者血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平升高可能与脑内Aβ沉积有关，其机制可能与miR-98-5p 能够抑制分选连接蛋白6表达和miR-142-5p能够抑制非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1（PTPN1）有关。分选连接蛋白6可参与调控蛋白质运输，通过调节β 分泌酶的内吞作用，影响淀粉样蛋白前体蛋白的β加工，从而抑制Aβ 沉积［16］。有研究表明，下调miR-98-5p 能够通过上调分选连接蛋白6 抑制Aβ 沉积［17］。PTPN1 是一种蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白，能够通过灭活糖原合成酶激酶3抑制Aβ沉积。有研究报道，下调miR-142-5p能够靶向上调PTPN1 抑制AD 大鼠脑内Aβ 沉积和神经炎症［18］。认知功能损害是AD 患者常见的临床表现。MMSE 是临床评估AD 患者认知功能的常用量表［1］。本研究结果发现，观察组MMSE 评分显著低于对照组，提示AD 患者存在明显的认知功能损害。进一步分析发现，AD患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平与MMSE 评分均呈负相关关系。提示血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平升高与AD 患者认知功能降低有关，其原因与miR-98-5p、miR-142-5p 能够参与AD患者脑内Aβ沉积有关。

本研究ROC 曲线分析显示，血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平单独和联合诊断AD 的AUC分别为0.782、0.791、0.887，血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平联合诊断AD 的AUC高于血清miR-98-5p、miR-142-5p水平单独。提示miR-98-5p、miR-142-5p可作为诊断AD 的血清生物标志物，二者联合能够提高其诊断价值。

综上所述，AD 患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平显著升高，其水平升高与Aβ 沉积和认知功能降低密切相关；miR-98-5p、miR-142-5p 有可能成为诊断AD的血清生物标志物。