Cag A阳性幽门螺杆菌对胃癌细胞lncRNA DLEU2表达及上皮间质转化的影响

曲雪，刘琦，赵鑫，邢元欣，郏雁飞，郑燕，杨炜华，汪运山，韩淑毅

1 山东第一医科大学（山东省医学科学院）研究生院，济南 250117；2 山东大学齐鲁医学院；3 山东第一医科大学附属中心医院医学实验诊断中心；4 山东第一医科大学附属中心医院基础医学研究中心；5 山东第一医科大学附属中心医院专科转化研究中心

胃癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，在全球范围内其发病率和死亡率分别居第四位、第三位，已成为严重威胁人类生命与健康的重大疾病之一。幽门螺杆菌（Hp）感染是目前最明确的胃癌致病因素［1］。细胞毒素相关蛋白A（Cag A）是Hp 的重要毒力因子［2］。有研究报道，Cag A 阳性Hp 感染者胃癌的发病风险是Cag A 阴性Hp感染者的两倍［3］；Cag A能够通过调控多种细胞信号通路诱导胃癌细胞增殖、侵袭、迁移并抑制其凋亡［4-5］。长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸且不具备蛋白编码功能的RNA 分子［6］。近年研究发现，lncRNA 能够参与包括胃癌在内多种肿瘤的发生、发展，而Hp 感染可诱导胃黏膜上皮细胞中部分lncRNA 差异表达，这些差异表达的lncRNA 可能在胃癌发生、发展中发挥重要的调控作用［7］。淋巴细胞白血病缺失基因2（DLEU2）属于lncRNA 家族成员之一，定位于人类染色体13q14区域［8］。本课题组前期生物信息学分析发现，胃癌组织DLEU2 异常表达，并且其异常表达可能与Hp感染有关［8］。2022年1月—7月，我们探讨了Cag A 阳性Hp 对胃癌细胞lncRNA DLEU2 表达及上皮间质转化的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞系HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 以及人正常胃黏膜上皮细胞系GES1，购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。Hp NCTC标准菌株 26695、11637，由山东大学齐鲁医学院贾继辉博士惠赠。所有引物序列购自日本Ta⁃KaRa 公司。LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪，购自瑞士Roche公司。逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司。Cag A抗体，购自美国GeneTex公司；神经钙黏着蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH 一抗及其相应二抗，购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.2 胃癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞DLEU2 表达检测 将HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28、GES1细胞接种于含10% FBS、1%青链霉素双抗的RPMI 1640 培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养48 h。待细胞贴壁生长至90%融合时，收集细胞。采用TRIzol 法提取细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0、OD260/OD230≥2.0。按逆转录试剂盒说明，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，按UltraSYBR Mixture 试剂盒说明进行PCR 扩增。引物序列：DLEU2 上游引物5'-GGCGGCGGGTACTTATCTC-3'、下游引物5'-CCAGGGAAGGATGTAGCTGTG-3'，GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'、下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。按试剂盒说明配制PCR 反应体系。反应条件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、61 ℃ 1 min 共45 个循环。PCR 反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值（CT）数。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算DLEU2 相对表达量。选择DLEU2 相对表达量最高的胃癌细胞进行后续实验。

取2×107cfu/mL Cag A 阳性NCTC 26695、11637各100 μL，用一次性接种环均匀涂布于弯曲杆菌琼脂基础培养基，置于85% N2、10% CO2、5% O2的三气培养箱。培养3～5天，收集NCTC 26695、11637，加入1 mL无菌PBS 制成细菌悬液，采用麦氏比浊仪检测细菌悬液浊度。按照感染复数100∶1 将正常胃黏膜上皮细胞、胃癌细胞分别与NCTC 26695、11637 共培养。分别于共培养0、3、9、12 h，按上述步骤检测DLEU2相对表达量。

1.3 Cag A、N-cadherin、Vimentin 表达检测 收集与NCTC 26695 或11637 共培养3、9、12 h 时正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，经BCA 法蛋白定量合格。加入上样缓冲液，100 ℃水浴变性。取变性蛋白，SDS-PAGE 分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2.5 h，分别滴加Cag A 一抗及其内参β-actin一抗以及N-cadherin、Vimentin一抗及其内参GAPDH 一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或小鼠IgG 二抗，室温孵育45 min，ECL 发光，暗室内曝光、显影。采用凝胶成像系统拍照，Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin 或GAPDH 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Student′s-t检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞DLEU2 表达比较 GES1、HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 细胞DLEU2相对表达量分别为1.00 ± 0.12、3.69 ± 0.51、3.32 ± 0.26、3.17 ± 0.55、2.52 ± 0.19。HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 细胞DLEU2 相对表达量均高于GES1 细胞（P均＜0.05）。在胃癌细胞中，以HGC-27 细胞DLEU2 相对表达量最高。因此，选择HGC-27细胞进行后续实验。

2.2 与NCTC 11637或26695共培养不同时间HGC-27细胞与GES1细胞DLEU2表达比较 见表1。

表1 与NCTC 11637或26695共培养不同时间HGC-27细胞与GES1细胞DLEU2相对表达量比较（±s）

表1 与NCTC 11637或26695共培养不同时间HGC-27细胞与GES1细胞DLEU2相对表达量比较（±s）

注：与同细胞同菌株共培养0 h 比较，*P＜0.05；与同细胞同菌株共培养3 h 比较，#P＜0.05；与同细胞同菌株共培养9 h 比较，△P＜0.05；与同细胞NCTC 26695菌株共培养同时间比较，▲P＜0.05；与GES1细胞同菌株共培养同时间比较，▽P＜0.05。

细胞GES1菌株DLEU2共培养9 h 3.21 ± 0.73*0.47 ± 0.04 1.12 ± 0.12▲1.05 ± 0.02#▽共培养3 h 1.97 ± 0.03*1.62 ± 0.58 0.70 ± 0.03▲▽1.25 ± 0.02 HGC-27共培养12 h 2.14 ± 0.04*#▲0.41 ± 0.00 1.52 ± 0.07*#▽0.59 ± 0.06#△NCTC 11637 NCTC 26695 NCTC 11637 NCTC 26695共培养0 h 1.00 ± 0.06 1.02 ± 0.25 0.93 ± 0.10 1.00 ± 0.17

2.3 与NCTC 11637或26695共培养不同时间HGC-27细胞和GES1细胞Cag A、N-cadherin、Vimentin表达比较 见表2。

表2 与NCTC 11637或26695共培养不同时间HGC-27细胞和GES1细胞Cag A、N-cadherin及Vimentin相对表达量比较（±s）

表2 与NCTC 11637或26695共培养不同时间HGC-27细胞和GES1细胞Cag A、N-cadherin及Vimentin相对表达量比较（±s）

注：与同细胞同菌株共培养3 h比较，*P＜0.05；与同细胞同菌株共培养9 h比较，#P＜0.05。

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2.4 与NCTC 11637 或26695 共培养HGC-27 细胞DLEU2、Cag A 表达与N-cadherin、Vimentin 表达的关系 Pearson 相关分析显示，与NCTC 11637 共培养HGC-27 细胞DLEU2 表达与N-cadherin、Vimentin 表达均呈正相关关系（r分别为0.98、0.99，P均＜0.05），Cag A 表达与N-cadherin、Vimentin 表达均呈正相关关系（r分别为0.88、0.92，P均＜0.05），并且DLEU2 表达与Cag A 表达亦呈正相关关系（r=0.93，P＜0.05）；与NCTC 26695 共培养HGC-27 细胞DLEU2表达与N-cadherin、Vimentin表达均呈正相关关系（r分别为0.98、0.91，P均＜0.05），Cag A 表达与N-cadherin、Vimentin 表达均呈正相关关系（r分别为0.93、0.98，P均＜0.05），并且DLEU2 表达与Cag A表达亦呈正相关关系（r=0.83，P＜0.05）。

3 讨论

胃癌是一种起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤前列［1］。Hp 是一种可以长期定植于胃黏膜上皮的革兰阴性杆菌，能够引起胃黏膜病变，如萎缩、肠化、异型增生甚至癌变［9］。Hp 感染是目前最明确、最重要的胃癌致病因素［10］，但并非所有Hp 都会引起癌变。Cag A 阳性Hp菌株毒力较强，是胃炎、胃溃疡、胃癌等疾病的主要致病菌株［11］。因此，明确Cag A 阳性Hp 对胃癌细胞中特异性分子表达的影响，将有助于更好地了解其致癌机制，从而为胃癌诊断与治疗提供新的思路。

lncRNA 是一类转录本长度超过200 个核苷酸且不具备蛋白编码功能的RNA 分子［6］。相较于其他非编码RNA，lncRNA 的生物学功能复杂，能够调控其他基因以及非编码RNA 转录、转录后修饰、蛋白翻译、翻译后修饰等过程［12］。有研究报道，胃癌细胞中存在多种lncRNA 表达失调［9］。DLEU2 属于lncRNA 家族成员之一，定位于人类染色体13q14 区域［8］。DLEU2 在多种恶性肿瘤中具有促癌作用，并且与患者预后不良密切相关［13］。有研究发现，胃癌组织DLEU2 表达显著升高，并且其异常表达与肿瘤病理分级和TNM 分期显著相关［14］。有研究还发现，DLEU2 高表达与胃癌患者预后较差密切相关［8］。HU 等［15］研究认为，DLEU2 可通过调控PI3K/Akt 信号通路促进胃癌的发生、发展。本研究结果发现，HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 细胞DLEU2 相对表达量均显著高于GES1 细胞，进一步验证了胃癌细胞中DLEU2 高表达。在胃癌细胞中，以HGC-27细胞DLEU2 相对表达量最高。因此，选择HGC-27细胞进行后续实验。

虽然Hp感染是目前最明确的胃癌致病因素，但Hp 感染导致胃癌发生的机制仍不十分清楚［9］。本课题组前期生物信息学分析发现，胃癌组织DLEU2异常表达，并且其异常表达可能与Hp 感染有关［8］。本研究结果显示，NCTC 11637 感染3、9、12 h 时GES1 细胞DLEU2 相对表达量均高于NCTC 11637感染0 h 时；NCTC 11637 感染12 h 时HGC-27 细胞DLEU2 相对表达量高于NCTC 11637 感染0 h 时。结果提示，NCTC 11637 感染能够促进GES1 细胞和HGC-27 细胞DLEU2 表达。Hp 可分泌Cag A、Vac A等毒力因子，其中Cag A 阳性Hp 菌株能够显著增加胃癌的发生风险［16］。NCTC 26695 感染3、9、12 h 时GES1 细胞或HGC-27 细胞DLEU2 相对表达量与NCTC 26695感染0 h时比较差异无统计学意义。进一步研究发现，NCTC 11637 感染12 h HGC-27 细胞与GES1细胞Cag A相对表达量均高于NCTC 26695，提示DLEU2 表达差异与Hp 菌株进入HGC-27 细胞或GES1 细胞中毒力因子Cag A 多少有关。NCTC 11637 感染GES1 细胞Cag A 相对表达量9 h＞12 h＞3 h；NCTC 26695 感染GES1 细胞Cag A 相对表达量3 h＞9 h＞12 h。NCTC 11637 感染HGC-27 细胞Cag A相对表达量12 h＞9 h＞3 h；NCTC 26695 感染HGC-27细胞Cag A 相对表达量3 h＞9、12 h。NCTC 11637、26695 感染12 h 内Cag A 相对表达量变化与DLEU2相对表达量变化趋势相同。Pearson相关分析显示，与NCTC 11637 或26695 共培养的HGC-27 细胞和GES1细胞DLEU2表达与Cag A 表达呈正相关关系。据报道，Cag A 可激活致癌信号通路，从而导致信号通路依赖的癌基因表达上调［5］，而DLEU2 亦可通过信号通路促进胃癌进展。由此推测，Cag A 有可能通过上调DLEU2表达促进胃癌进展。

上皮间质转化是指上皮表型细胞向间质表型细胞转化的过程。上皮间质转化赋予了细胞侵袭和迁移的能力，是胃癌进展的重要原因。N-cadherin 和Vimentin 是上皮间质转化的标志性蛋白［17］。有研究报道，Cag A 阳性Hp 可导致胃黏膜上皮细胞发生上皮间质转化［4］，而DLEU2 可促进胃癌细胞迁移和侵袭［8］。本研究结果显示，NCTC 11637 感染HGC-27细胞N-cadherin、Vimentin 相对表达量12 h＞9 h＞3 h；NCTC 26695 感染HGC-27 细胞N-cadherin、Vimentin相对表达量3 h＞9 h＞12 h。NCTC 11637 或26695 感染12 h 内HGC-27 细胞N-cadherin、Vimentin 相对表达量变化与Cag A、DLEU2 相对表达量变化趋势相同。Pearson 相关分析显示，NCTC 11637 或26695 共培养的HGC-27 细胞DLEU2、Cag A 表达与N-cad⁃herin、Vimentin 表达均呈正相关关系。提示Cag A阳性Hp 可能是推动DLEU2 影响上皮间质转化的重要原因。

综上所述，Cag A 阳性Hp 能够引起胃癌细胞lncRNA DLEU2 异常表达，而DLEU2 异常表达可促进胃癌细胞上皮间质转化。