20%赤霉酸可溶粉剂高效液相色谱分析

周冉豪 秦 铭 王 睿*

(1.贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550014; 2.贵阳幼儿师范高等专科学校，贵州 贵阳 551400)

赤霉酸(Gibberellic acid)，化学名称为(3S，3aR，4S，4aS，7S，9aR，9bR，12S)-7，12-二羟基-3-甲基-6-亚甲基-2-氧全氢化-4a，7-桥亚甲基-9b，3-桥亚丙烯基薁并[1，2-b]呋喃-4-羧酸，其结构式见图1。它是一种广谱低毒植物生长调节剂，是植物体内普遍存在的五大内源激素之一，能促进作物细胞分裂与生长，促使植物生长发育，使植株增高、叶片增大，打破种子、块茎和鳞茎等器官的休眠，促进发芽，提高结果率或无核果实结实率，在棉花、水稻、马铃薯、水果、蔬菜等作物上广泛使用[1，2]。

图1 赤霉酸结构式

雷琪等[3]和王娟等[4]对赤霉酸与其他有效成分的复配制剂进行了高效液相色谱测定研究，吴爱娟等[5]和程华鹏等[6]也利用高效液相色谱仪对多种植物生长调节剂进行了同时测定。利用高效液相串联质谱分析检测赤霉酸的方法也有报道[7]。但对于含赤霉酸单一成分制剂的检测暂无报道，本实验在参照赤霉酸相关国家标准推荐方法[8]的基础上，对20%赤霉酸可溶粉剂中的有效成分进行定性及定量测定，按照农药登记管理中对检测方法的要求，将各项方法学指标逐一进行了验证，该方法操作简单，拥有良好的分离效果和线性关系，且精密度和准确度均符合要求，适用于企业生产质量控制。

1 实验部分

1.1 试剂和溶液

甲醇，色谱纯，Fisher Chemical；磷酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Milli-Q超纯水；磷酸水溶液，V水∶V磷酸=2 000∶1；赤霉酸标准物质，含量99.2%，上海市农药研究所有限公司；20%赤霉酸可溶粉剂、赤霉酸原药(含量90%)、制剂空白，重庆市诺意农药有限公司。

1.2 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，具有PDA检测器，色谱柱：Extend-C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；Empower色谱数据处理工作站；METTLER TOLEDO XSE205DU型电子天平；默克密理博超纯水系统。

1.3 高效液相色谱操作条件

流动相：V甲醇∶V磷酸水溶液=35∶65；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：210 nm。保留时间：赤霉酸约为8.8 min。标样与试样典型色谱图见图2、图3。

图2 赤霉酸标样色谱图

图3 20%赤霉酸可溶粉剂色谱图

1.4 测定步骤

1.4.1 标样溶液的配制

称取0.1 g赤霉酸标样于100 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，超声振荡5 min，冷却至室温，摇匀，得到赤霉酸的标样储备溶液；再用流动相将该储备溶液稀释成一系列浓度的标准工作溶液。

1.4.2 试样溶液的配制

称取含赤霉酸约0.05 g的20%赤霉酸可溶粉剂于100 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，超声振荡5 min，冷却至室温，摇匀，过滤。

1.5 测定

在1.3的色谱条件下，连续分析标样溶液，当前后两针峰面积相对变化小于1.5%时，按照标样、试样、试样、标样的进样顺序开始分析。

1.6 计算

试样中赤霉酸的质量分数X1(%)按下式计算：

式中：A1为标样溶液中赤霉酸峰面积的平均值；A2为试样溶液中赤霉酸峰面积的平均值；m1为赤霉酸标样的质量，g；m2为赤霉酸试样的质量，g；ω为标样中赤霉酸的质量分数；f为稀释因子，值为1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

将PDA检测器的检测波长调整为波长扫描范围为190～400 nm，对赤霉酸标样进行扫描(扫描结果见图4)。由于赤霉酸的化学结构中没有能产生强紫外吸收的基团，故选取不受甲醇等溶剂截止波长干扰的210 nm为检测波长。在该波长下，赤霉酸受到的干扰相对较少，灵敏度相对较高。

图4 赤霉酸紫外吸收曲线

选用Extend-C18柱，在1.3的高效液相色谱条件下，赤霉酸与杂峰分离较好，峰型尖锐对称，能够得到较好的分析结果。

2.2 特异性测定

采用HPLC-PDA扫描进行测定，赤霉酸(保留时间8.8 min)，峰“纯度角”始终小于“阈值”，表示该峰在此区域具有光谱一致性，色谱峰纯度图见图5。

图5 20%赤霉酸可溶粉剂中赤霉酸峰纯度图

2.3 线性相关性测定

在1.3的色谱条件下，将1.4.1中的标准工作溶液重复分析2次，取平均值。以质量浓度为横坐标、赤霉酸峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到赤霉酸的线性方程为y=9.07×103x-6.34×104，相关系数R2为0.999，校正曲线见图6。

图6 校正曲线图

2.4 非分析物干扰测定

在1.3的高效液相色谱条件下，对制剂空白、赤霉酸原药逐一进行高效液相色谱分析(图7)，分析结果显示，目标分析物能被有效分离，制剂空白和原药在目标分析物出现的区域无干扰峰存在，见图7。

图7 非分析物干扰测定图谱：制剂空白(A)和赤霉酸原药(B)

2.5 分析方法的精密度

准确称取5个供试物，在1.3的色谱条件下进行分析，结果见表1。20%赤霉酸可溶粉剂质量分数测定的变异系数为0.42%，小于Horwitz公式的计算值1.72%，说明该分析方法的精密度符合质量控制的要求。

表1 分析方法的精密度测定结果

2.6 分析方法的准确度试验

称取约0.2 g制剂空白于100 mL容量瓶内，按20%赤霉酸可溶粉剂中赤霉酸的含量，加入相应赤霉酸原药，再用流动相溶解并稀释至刻度，超声振荡5 min，冷却至室温，摇匀，平行操作5次，得到准确度试验溶液。在1.3的色谱条件下进行测定，得到赤霉酸的回收率范围为98.88%～100.57%，平均回收率为99.32%(结果如表2所示)，说明该方法有良好的准确度。

表2 准确度实验结果

3 结论

本研究中作者参照国家标准对20%赤霉酸可溶粉剂中赤霉酸进行液相色谱分析，该方法方便、快速，分离效果好，线性关系、准确度和精密度等各项方法学验证指标均符合要求，可用于原药或制剂中赤霉酸的定量分析及质量控制。