山羊溶酶体α-甘露糖苷酶不同结构域片段的制备及酶活性的鉴定

赵一宇，吴 莹，赵 影，赖 毕，李勤凡

(西北农林科技大学 动物医学学院 生物毒素实验室，陕西 杨凌 712100)

疯草(locoweed)是棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalas)有毒植物，因含毒性成分为苦马豆素(swainsonine,SW)，动物采食后不仅引起中毒死亡，还影响其繁殖和畜种改良[1-4]。在动物机体内，由于SW阳离子与甘露糖阳离子空间结构的相似性，SW对溶酶体α-甘露糖苷酶(lysosomal α-mannosidase，LAM)具有高度亲和性，从而成为LAM的强烈抑制剂。疯草中毒山羊血清LAM活性明显下降，在SW含量大于5×10-6mol/L时，LAM的活性几乎被全部抑制[5-6]，最终造成家畜体内低聚糖代谢和糖蛋白合成受阻。目前，动物疯草中毒的研究已有40多年，重点集中于对SW的毒性及脱毒方法研究，研制出的疯草灵缓释解毒丸[7]、预防疯草中毒的中药复方剂[8-9]和速康解毒口服液[10]等虽然取得了一定的疗效，但大规模生产和推广均受到了一定程度的限制，开展疯草敏感动物LAM结构与酶活性的研究，有利于拓展疯草中毒病的防治研究思路。

1 材料与方法

1.1 菌株及载体酵母表达菌株巴斯德毕赤酵母GS115、酵母表达载体pPIC9K和DH5α均由西北农林科技大学预防实验室提供；pMD19-T克隆载体购自大连宝生物公司。

1.2 主要试剂SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、LATaq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶均购自大连宝生物公司；DNA胶回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA resin及柱子、His标签鼠单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)购自北京全式金生物技术有限公司；DAB法显色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；p-硝基-苯基-α-D甘露糖苷购自Sigma公司；野生型chLAM蛋白由本实验室前期表达并保存。

1.3 引物设计根据GenBank中山羊α-甘露糖苷酶基因序列(JN602369.1)，使用Primer Premier 5.0软件设计4对特异性引物对含有保守活性位点的亚基片段A、C、D、T分别进行扩增。5′端均添加ATG，3′端均添加TAG和6×His Tag标签，两侧分别添加SnaBⅠ/NotⅠ酶切位点，引物序列见表1。

表1 引物信息

1.4 截短基因的获得及克隆载体的构建

1.4.1PCR扩增 取7月龄莎能奶山羊肝脏，用TRIzol试剂提取肝脏细胞的总RNA，逆转录为cDNA,以cDNA为模板分别扩增ChA、ChC、ChD和ChT基因片段。PCR反应体系为25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Super MixⅡ酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退30 s，72℃延伸1～2 kb/min，共35个循环；72℃延伸10 min。

1.4.2重组克隆质粒的构建及鉴定 将扩增片段进行胶回收后与pMD19-T载体连接,经蓝白斑筛选，获得pMD19T-ChA、pMD19T-ChC、pMD19T-ChD和pMD19T-ChT重组阳性质粒,同时进行菌液PCR，将阳性质粒送公司测序。

1.5 重组酵母表达质粒的构建及鉴定将4种重组阳性质粒和载体pPIC9K分别用SnaBⅠ和NotⅠ双酶切，分别回收酶切后目的片段与线性化后的pPIC9K，加入T4DNA连接酶于16℃连接过夜，构建重组酵母表达质粒pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPIC9K-ChD和pPIC9K-ChT。并将连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，涂布平板进行筛选培养。提取质粒进行双酶切鉴定，使用载体pPIC9K通用引物ADX筛选阳性菌落。

1.6 重组酵母菌的转化和鉴定参照文献[8]将线性化的4种重组酵母表达质粒电转化至GS115感受态细胞。电转条件：电容25 μF，电压1.5 kV，电阻200 Ω。筛选G418抗性菌株作为阳性转化子，菌落PCR鉴定重组菌。

1.7 重组酵母菌的诱导表达和酶活性检测参照文献[11]对重组酵母菌进行诱导表达，诱导表达120 h后分别收集上清和菌体沉淀。收集的酵母沉淀分别进行超声破碎，对重组酵母菌上清和菌体沉淀超声破碎后的上清进行α-甘露糖苷酶活性测定。

1.8 截短蛋白ChLAMt的纯化采用Ni柱纯化法,按Ni-NTA His·Bind resin说明书进行。经10%SDS-PAGE分析纯化的ChLAMt蛋白转印到PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉中封闭过夜。以His标签鼠单克隆抗体为一抗，4℃过夜孵育；TBST洗3次，以HRP标记羊抗鼠IgG(H+L)作为二抗，室温振荡孵育2 h，TBST洗膜3次，加入DAB显色。

1.9 pH、温度和金属离子对ChLAMt活性的影响在pH4.5、不同温度(25～75℃)条件下测定酶的最适温度；在50℃、不同pH(3.0～8.0)条件下测定酶的最适pH；测定Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Al3+、EDTA离子对ChLAMt活性的影响；在50℃、pH5.5条件下设定不同的底物浓度与样品反应，建立回归曲线计算ChLAMt米氏常数(Km)；试验重复3次并求其平均值。

1.10 数据统计试验数据用SPSS 24.0 软件t检验分析差异显著性。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 截短片段克隆的鉴定PCR法获得ChA(878 bp)、ChC(480 bp)、ChD(730 bp)和ChT(2730 bp)4个截短基因片段，其大小与预期片段理论值相符(图1)。

M.DL5000 DNA Marker；1.ChA片段扩增产物；2.ChC片段扩增产物；3.ChD片段扩增产物；4.ChT片段扩增产物

2.2 重组表达质粒的鉴定对提取的构建成功的重组酵母质粒pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPI-C9K-ChD和pPIC9K-ChT使用载体通用引物进行测序，结果读码框正确。

2.3 重组酵母菌株基因组PCR 扩增结果扩增结果显示，pPIC9K空质粒及pPIC9K-重组质粒均已成功转化到酵母表达菌株GS115中，重组质粒和重组菌基因组的PCR结果中可见特异性条带，与目的基因扩增结果相符(图2)。

M.DL5000 DNA Marker；1.ChT片段扩增；2.pPIC9K-ChLAMt重组质粒扩增；3.pPIC9K-ChLAMt重组菌基因组扩增；4.空白pPIC9K重组菌基因组扩增

2.4 表达产物酶活性检测pPIC9K-ChT重组酵母菌表达上清D405 nm值为0.298 5，菌体沉淀超声破碎后D405 nm值为0.298 5，求得阳性重组酵母菌株GS115/pPIC9K-ChT诱导表达产物中ChLAMt活性为35 U。而pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPIC-9K-ChD阳性重组菌株表达上清的D405 nm值均为0.000 0，3个重组菌株菌体超声破碎后D405 nm值均为0.000 0，这3个小片段所构建的阳性酵母菌株对其特异底物均无酶活性。

2.5ChLAMt的SDS-PAGE和Western blot鉴定SDS-PAGE通过计算机成像分析，Western blot试验检测到PVDF膜在90 kDa左右处有目的条带，即为检测的ChLAMt蛋白条带(图3，4)。

M.蛋白Marker；1,2.均为已纯化的ChLAMt蛋白

1,2.均为已纯化的ChLAMt蛋白

2.6 表达产物ChLAMt的特性鉴定通过测定不同温度、pH及存在各种金属离子或者抑制物的情况下(图5,6)Zn2+、Ca2+能使酶活性升高(图7)。对表达产物ChLAMt进行米氏常数的测定，分析表达产物ChLAMt对不同浓度梯度的特异性底物的作用结果，利用双倒数作图法作图，计算表达产物ChLAMt的米氏常数(Km)=0.93。

图5 温度对截短型ChLAMt和野生型ChLAM蛋白活性的影响

图6 pH对截短型ChLAMt和野生型ChLAM蛋白活性的影响

图7 金属离子和抑制物对截短型ChLAMt蛋白和野生型ChLAM蛋白活性的影响

3 讨论

家畜疯草中毒对草原畜牧业危害严重，学术界一直致力于家畜疯草中毒的防治研究，并取得了一定的进展，但至今没有易于推广的防治方法。棘防A、C和D号理论上能破坏SW的结构，棘防B、E号提高动物体内LAM的活性[12]，但尚未见解毒机制方面的研究报道。在使用效果方面，给绵羊服用棘防A号，虽然能推迟中毒症状出现的时间，但还不能完全预防疯草对绵羊内脏器官的损害作用[13]。王保海等[9]研制的预防疯草中毒的中药复方剂，主要由陈皮、升麻等中药和微量元素混合剂组成，其解毒原理是提高机体免疫力、促进代谢，但并非针对疯草中毒的特异性解毒剂。郝宝成[10]研制的速康解毒口服液由酵母甘露聚糖、正磷酸钠、L-鼠李糖等原料按一定比例组成，理论上推测可诱导LAM的合成，尚未进行试验验证。同时，SW抑制LAM的能力极强，即使补充酶合成的原料能促进酶的合成，多产生的酶也被SW抑制，难以从根本上解毒。家畜食用参考文献[14]报道的疯草解毒剂后一定时间内采食疯草不会引起中毒，解毒剂中的亚铁盐、锌盐、铜盐的物质量比理论上具有毒性，且预防时间短，一次给药不能使动物度过荒草期。由于现有解毒剂的局限性，探索效果更优的疯草解毒剂势在必行。

LAM属于糖苷水解酶38家族(GH38)，具有外切甘露糖的活性，可催化天冬酰胺连接的α1,2-高甘露聚糖、α1,3-高甘露聚糖、α1,6-高甘露聚糖的水解。在动物细胞内，LAM缺陷或酶活被SW抑制后，会引起N-聚糖代谢异常，出现溶酶体贮积症和动物疯草病。酶替代疗法(enzyme replacement therapy，ERT)已被用于治疗轻至中度溶酶体贮积症[15]，因此开展ERT研究将是治疗动物疯草中毒的有益尝试。目前,对疯草敏感动物LAM的研究十分有限，制约了ERT治疗疯草中毒的研究。仅有的研究表明，ChLAM蛋白基因编码的蛋白相对分子质量大，外源表达蛋白表达量少，活性低[16]。本试验根据文献[11]对ChLAM蛋白分子对接分析和蛋白空间晶体结构等的预测结果，对ChLAM蛋白各结构域进行截短表达，以解析蛋白亚基结构域与催化活性之间的关系，结果显示ChA，ChC，ChD所编码的蛋白均没有LAM活性，ChT表达产物与野生型蛋白有相似的酶活、最适温度及pH。截短型蛋白ChLAMt的热稳定性高于野生型蛋白，可能截去E亚基降低了二级结构中无规则片段的含量，使螺旋含量增加引起的；同时，野生型蛋白具有更强的耐酸性；Zn2+、Ca2+对ChLAMt活性均有促进作用，与文献报道ChLAM的性质一致[16]。ChT比野生型LAM蛋白缺少E亚基，包含A、C、D 3个亚基中高度保守的催化活性位点，单独的A、C、D 3个亚基虽含有催化活性位点，但不能产生LAM活性，意味着3个亚基高度保守的活性位点共同参与酶催化反应。本试验研究LAM截短体酶学性质，就是要为进一步开展疯草中毒病ERT治疗研究提供资料。