基于鸡白痢沙门菌LPS的D群沙门菌抗体间接ELISA检测方法的建立

蒋凤娇,程伊洛，汪 最，张文婷，卢 琴，郭云清，罗青平，邵华斌，张腾飞*

(1.湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064；2.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070)

鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种急性全身性疾病，多发于2～3周龄内的雏鸡，成年鸡亦可被感染，可垂直传播和水平传播，病死率极高[1]，难以根治，严重影响着我国养殖业的发展。在我国，种鸡净化是防制鸡白痢的关键手段，而净化的核心在于准确检出感染的个体[2]，我国《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》中明确指出沙门菌是种鸡场需要净化的种源性疫病[3]。

现有的鸡白痢检测方法主要有传统的细菌分离鉴定，以及以免疫学和分子生物学等为基础的检测技术，如平板凝集、PCR等方法[4-5]。其中，最常用的是全血或血清平板凝集试验，该方法简单方便，但灵敏度偏低，不稳定，容易引起非特异性反应[6]。因此，亟待开发一种特异性强、灵敏性高的鸡白痢抗体检测方法。

沙门菌具有复杂的抗原结构，主要包括菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原以及荚膜(Vi)抗原[7]。沙门菌血清型分类的主要依据是细菌表面O抗原的差异[8]。根据O抗原的不同，至少可将沙门菌分为A群、B群、C群、D群等37个血清群[9]，其中D群沙门菌主要包括了鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌等。感染家禽的主要为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌等。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)位于革兰阴性菌的细胞壁外膜，主要由O抗原、核心多糖和类脂A三部分组成。LPS的O抗原是抗原决定因子，具有高度特异性，可用于区分不同血清型的细菌[10]。OIE认为用LPS作为包被抗原的间接ELISA是测定鸡群中鸡白痢、鸡伤寒沙门菌感染最特异的方法[11]。目前,国内并没有获批的检测鸡白痢抗体的商品化ELISA检测试剂盒。因此，本研究以鸡白痢沙门菌的LPS作为包被抗原，建立D群沙门菌抗体间接ELISA检测方法，旨在为鸡白痢沙门菌等D群沙门菌感染的抗体检测提供有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌种及血清鸡白痢沙门菌TC3株为本实验室鉴定筛选并保存[12]。鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、都柏林沙门菌、鼠伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、鸭沙门菌、大肠杆菌等菌株的阳性血清和阴性血清均由本实验室制备。鸡白痢阳性对照血清购自中国兽医药品监察所。467份临床血清采集自湖北某养殖场。

1.2 主要试剂及仪器DNaseⅠ、RNase A、Proteinase K、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、快速银染试剂盒、Bradford蛋白质量浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原购自中国兽医药品监察所；D群沙门菌(group D)抗体检测试剂盒购自荷兰BioChek公司；HRP标记的兔抗鸡IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；ELISA显色液、终止液、明胶、胎牛血清、封闭用马血清和封闭用兔血清购自索莱宝公司；BSA购自Sigma公司；脱脂牛奶购自BD公司；其他试剂为国产分析纯级。台式高速冷冻离心机购自美国Thermo Fisher公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 包被抗原的制备采用改良的热酚水法提取[13]。将鸡白痢沙门菌TC3株增菌并收集菌体，反复冻融3次后超声破碎。加入等体积95%苯酚溶液，68℃水浴加热并剧烈搅拌30 min。冷却后离心，收集上层水相，下层酚相按上述方法重复抽提2次，合并水相并转移到透析袋中，蒸馏水透析48 h，直至无苯酚气味残留。加入终质量浓度为50 mg/L的DNaseⅠ和RNase A，37℃作用4 h后，加入终质量浓度为100 mg/L的Proteinase K，65℃作用2 h，沸水浴10 min。再次苯酚抽提，去除核酸酶和蛋白酶。乙醇沉淀后，干燥，经SDS-PAGE及银染鉴定正确后，-20℃保存。

1.4 间接ELISA最佳反应条件的建立

1.4.2最佳封闭条件的确定 按照1.4.1得到的最佳包被条件包被抗原，分别用1%BSA、1%明胶、5%脱脂乳、10%胎牛血清、10%马血清、10%兔血清于37℃封闭2 h，其余步骤按照1.4.1的间接ELISA试验步骤进行，筛选出最佳封闭剂后，用该封闭剂分别封闭60，90，120，150 min，测定各孔的D630 nm值，比较P/N，确定最佳封闭时间。

1.4.3血清最佳作用时间的选择 按照1.4.1和1.4.2得到的最佳包被条件包被抗原，最佳封闭条件进行封闭，血清分别于37℃孵育30，45，60，90，120，150 min，其余步骤按照1.4.1的间接ELISA试验步骤进行，测定各孔的D630 nm值，比较P/N，确定血清最佳作用时间。

1.4.4酶标二抗最适工作质量浓度和时间的选择 按照1.4.1～1.4.3得到的最佳包被条件包被抗原，最佳封闭条件进行封闭，血清最佳作用时间进行孵育，依次将酶标二抗稀释1 000～10 000倍，分别作用20，30，45，60，75，90 min，测定各孔的D630 nm值，比较P/N，确定酶标二抗最适工作质量浓度和作用时间。

1.4.5底物最适显色条件 按照1.4.1～1.4.4得到的最佳包被条件、最佳封闭条件，最适一抗、二抗作用浓度及时间，进行间接ELISA试验，分别显色5，8，10，12，15，17 min，测定各孔的D630 nm值，比较P/N，确定最适显色时间。

1.4.6间接ELISA阴阳性判定标准的确定 用建立的间接ELISA检测方法对已知的弱阳性血清进行检测，并将阳性对照标准化稀释至合适浓度，参考D630 nm值，按S/P公式建立合适的样品判定标准[14]，并用平板凝集试验和D群沙门菌抗体检测试剂盒进行验证。S/P=(待检样本平均值-阴性对照平均值)/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)。

1.5 方法的验证

1.5.1特异性试验 用建立的间接ELISA检测方法，分别对鸡白痢沙门菌(2株标准型、3株变异型、10株临床分离型)、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、都柏林沙门菌、鸭沙门菌、猪霍乱沙门菌、甲型副伤寒沙门菌和大肠杆菌等菌株的阳性血清进行间接ELISA检测，并以鸡白痢阳性血清作阳性对照，以SPF鸡血清作阴性对照，测D630 nm值，根据结果判定标准，验证特异性。

曾经的芳华人影俱销，宝玉得了一场不大不小的病，总是持续高烧不退，先是被疑似非典，以后又差点当成禽流感。宝钗寸步不离汤水伺候得妥帖。病愈后的宝玉，涕泪交加，忏悔起和黛玉的陈仓暗渡。宝钗并不见怪，反而道：“也是天缘注定吧。林妹妹总要找个归宿才好……”一席话说得宝玉自愧不如，宝钗又劝：“你这样放不下，反而伤了身子，她也觉着不好……”宝玉不解，宝钗道：“我看，你索性写本书，对过去权作告别交代……也好让林妹妹轻轻松松嫁人……”宝钗这样心无罅隙，自己再推脱，就是心里不坦荡了。

1.5.2敏感性试验 将鸡白痢阳性血清依次按1∶100～1∶51 200倍比稀释，用建立好的间接ELISA检测方法进行效价检测。同时将血清倍比稀释并用鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原进行检测。

1.5.3重复性试验 使用不同批次提取的LPS作为包被抗原，对随机选取的3份鸡白痢阳性血清和3份阴性血清进行检测。同时使用同一批次提取的LPS作为包被抗原包被不同的酶标板，对上述6份血清进行检测，用酶标仪测D630 nm值，计算平均值、标准差和变异系数。

1.5.4符合率试验 分别用建立的间接ELISA检测方法和group D抗体检测试剂盒对283份临床血清样本进行检测，并对检测结果进行符合率比较。

1.6 临床初步应用分别用建立的间接ELISA检测方法和平板凝集对湖北某种鸡场的184份临床血清进行检测。

1.7 统计学分析收集试验数据，用SPSS软件进行分析。符合率试验中，通过单因素方差分析进行组间比较。检出率试验中，通过独立样本t检验进行2组之间的比较。检验过程中，P<0.05有统计意义，其中P<0.05，代表差异显著；P<0.01，代表差异极显著。

2 结果

2.1 LPS的提取收集的菌体湿重为6.5 g，提纯的LPS为95.1 mg(产率1.463%)。称取20 mg LPS溶于2 mL超纯水中，测得蛋白含量为0.099 5 g/L。采用苯酚-硫酸法测得多糖含量为8.940 g/L。对提取的LPS进行SDS-PAGE及银染，LPS呈现阶梯结构(图1)，证明LPS提取成功且结构完整。

M.蛋白Marker；1,2.纯化的LPS

2.2 间接ELISA最佳反应条件的建立反应条件优化的结果：抗原包被质量浓度为2.233 mg/L，最适封闭条件为5%脱脂乳封闭60 min，血清最佳稀释度为1∶200，血清最佳作用时间为60 min,酶标二抗最适工作质量浓度为1∶8 000，作用时间为60 min，显色时间为15 min。阴阳性判定标准：当S/P值≥0.5时，判断抗体阳性；当S/P值<0.5时，判断抗体阴性。以优化的反应条件为参数，建立鸡白痢抗体间接ELISA检测方法。

2.3 方法的验证

2.3.1特异性试验 根据间接ELISA判定标准，对结果进行判定。结果显示，D群沙门菌(包括鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、都柏林沙门菌)对应的阳性血清抗体检测结果均为阳性，鼠伤寒沙门菌(B群)、猪霍乱沙门菌(C1群)、鸭沙门菌(E1群)、大肠杆菌(O1)抗体检测结果均为阴性，但是甲型副伤寒沙门菌(A群)抗体检测结果为弱阳性(表1)。

表1 特异性试验结果

2.3.2敏感性试验 将倍比稀释的鸡白痢阳性血清用建立的间接ELISA方法进行检测，结果表明当血清1∶3 200倍稀释后仍为阳性(图2)。平板凝集试验结果显示，血清最高稀释8倍后为阳性，16倍稀释后为阴性。结果表明，建立的间接ELISA检测方法检测敏感性是平板凝集的400倍，具有较高的检测敏感性。

图2 敏感性试验结果

2.3.3重复性试验 将同一批次和不同批次提取的LPS分别包被酶标板进行检测，结果显示建立的间接ELISA批内重复变异系数(表2)和批间重复变异系数(表3)均小于10%，表明该方法具有良好的重复性。

表2 批内重复试验结果

表3 批间重复性试验结果

2.3.4符合率试验 用建立的间接ELISA检测方法和group D抗体检测试剂盒对283份临床血清样本进行检测，并对检测结果进行符合率比较。结果显示,阳性样本符合率为94.67%，阴性样本符合率为98.11%，总符合率为98.59%，Kappa系数为0.963，符合率高(表4)。

表4 不同检测方法的符合性试验结果 份

2.4 临床初步应用分别用平板凝集和建立的间接ELISA检测方法对湖北某地方种鸡场的184份临床血清进行检测。结果显示，平板凝集检测出阳性8份，阴性176份，阳性率为4.35%，间接ELISA检测出阳性24份，阴性160份，阳性率为13.04%，显著高于平板凝集的检出率(P<0.05)。

3 讨论

鸡白痢沙门菌是严重危害我国家禽养殖业发展的病原菌之一。最常用的检测方法是平板凝集试验，但该方法的稳定性与特异性存在不足，检测结果易受人为主观因素影响，容易出现假阳性和漏检等情况[15]。相比平板凝集，本试验建立的间接ELISA检测方法敏感性是平板凝集的400倍，远高于现有的平板凝集试验。因此，在临床血清样品检测中，间接ELISA更便于检出鸡白痢阳性感染个体，有助于更好地开展鸡白痢净化。

在间接ELISA试验中，抗原质量对试验结果影响很大，本研究通过动物试验筛选抗原性较好的菌株，并对提取的不同菌株的LPS进行初步验证，最终筛选出免疫原性和特异性都较好的鸡白痢沙门菌TC3株。另外，提取高纯度的LPS也至关重要，本研究采用改良的热酚水法提取鸡白痢沙门菌的LPS，加入蛋白酶消化后，再次用热酚水法去除蛋白酶，可以显著提高LPS的纯度。薛丽芝[16]提取的沙门菌LPS产率为1.130%，蛋白含量为64.940 0 g/L。本试验方法提取的LPS的产率为1.463%，蛋白含量为0.099 5 g/L，证明本试验方法提取的LPS的产率较高且蛋白含量较低。

包被抗原的特异性对检测结果有重要的影响。D群沙门菌具有高度相似的O抗原结构，因此基于鸡白痢沙门菌LPS建立的间接ELISA检测方法不仅可检测出鸡白痢沙门菌的抗体，也可检测出同属于D群沙门菌的肠炎沙门菌和都柏林沙门菌的抗体，这种D群之间的交叉反应在平板凝集试验中也得到了证实[17]。但是，由于LPS具有复杂的抗原结构，不同血清群沙门菌的O抗原结构也具有一定的相似性，因此，抗原的特异性需要进行尽可能全面的验证。黄仕霞等[18]在利用沙门菌O抗原建立鸡沙门菌抗体ELISA检测方法试验中，特异性验证使用鸡支原体、鸡新城疫、马立克病毒等阳性血清；胡建乐[19]基于鸡白痢沙门菌LPS建立的间接ELISA检测方法特异性验证试验中，使用肠炎沙门菌、变形杆菌、巴氏杆菌等阳性血清；与之相比，本方法在特异性验证试验中，阳性血清样品包括A群、B群、C群、D群、E群等多个血清群，较为全面地评估了不同血清群之间的特异性，且该方法与D群沙门菌抗体检测试剂盒的符合率较高，进一步证明了该方法特异性良好，检测结果准确可靠，可以应用于包括鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌在内的D群沙门菌感染抗体的检测。

该方法在检测鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌等病原菌的阳性血清时，展现出良好的特异性，但是对甲型副伤寒沙门菌(A群)的检测结果为弱阳性。研究表明，鸡白痢沙门菌的O抗原有O1、O9、O12，甲型副伤寒沙门菌的O抗原有O1、O2、O12，二者具有相似的抗原，可能是其存在交叉反应的原因。但是，甲型副伤寒沙门菌并不感染家禽，因此不影响该方法对家禽抗体的检测。也有文献建议，基于沙门菌O抗原的复杂性可能导致非特异性反应，在抗体检测后可对检测阳性鸡只进一步进行细菌学检测[20]。

综上，本试验建立了基于鸡白痢沙门菌LPS作为包被抗原的抗体间接ELISA检测方法，可特异性检测鸡白痢沙门菌等D群沙门菌感染，将为种鸡场沙门菌净化提供有效的工具，其中对多个血清群的特异性验证也为基于鸡白痢沙门菌LPS作为包被抗原的抗体检测的准确性提供更多科学数据。