陕西省及甘肃省部分地区山羊和绵羊干酪性淋巴结炎样脓肿中病原菌种类的调查与分析

王 斌，魏宇辰，白新栋，王晨骁，冯 航，杨增岐

(西北农林科技大学 动物医学学院，陕西 杨凌 712100)

干酪性淋巴结炎(caseous lymphadenitis，CLA)是一种人兽共患慢性传染病，其中以羊的发病和危害最为广泛和严重，在全球多地均有羊干酪性淋巴结炎的流行报道[1-2]。羊干酪性淋巴结炎以局部干酪性脓肿为主要特征，根据发病部位的不同可分为体表型、内脏型和混合型，体表型多见于下颌、肩前和肷部，内脏型多见于肺脏和肝脏[3]。通常情况下，该病在羊群中病死率较低，但其对羊群的危害仍不可忽视，羊患病后表现为渐进性消瘦，导致饲料转化率降低和生产性能下降；另一方面，病程后期脓肿部位破溃后，脓肿内容物外流可能会造成皮毛、乳肉制品和环境污染，对羊只经济价值、公共卫生安全和羊群疫病风险等方面均有不利影响[4]。通常认为，伪结核棒状杆菌是羊CLA的病原菌[5]，伪结核棒状杆菌因为具有感染后宿主常为慢性病理过程而不致死、能够逃避宿主免疫系统、体内外可长期生存等特点，因此被称为“完美寄生虫”[1]。然而，随着国内外关于羊CLA研究的深入，诸多研究成果表明羊CLA脓肿内容物中分离的病原菌并不是伪结核棒状杆菌一种病原菌[6-11]，除伪结核棒状杆菌外，金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌是其中最为多见的2种细菌。截止目前，我国关于羊CLA的病原研究基本上均以山羊为主，本试验除对山羊CLA进行病原研究外，还将我国陕西关中地区山羊与甘肃庆阳地区绵羊CLA样脓肿的发病率和病原分离率进行对比分析，能够进一步充实我国关于羊CLA病原的研究数据，以期最终为该病的防治方法和净化措施研究提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 养殖场及试验动物山羊均为陕西关中地区的8家养殖场中的奶山羊，绵羊均为甘肃庆阳地区14家养殖场中的湖羊。

1.2 群体发病率调查在养殖场内全群筛查，记录羊群总数和其中出现CLA样体表脓肿羊的数量，发病率=发病羊数/羊群总数×100%。

1.3 样品信息随机选择发病羊，病羊体表脓肿部位表面消毒后，使用20 mL一次性无菌注射器抽取内容物约2 mL，转移至无菌离心管中，于2～8℃保存运输至实验室。共获得山羊体表脓肿样品135份，绵羊体表脓肿样品107份。

1.4 单只羊体表多处脓肿统计将单只羊体表不同部位出现2处及2处以上脓肿的现象称为单只羊多处脓肿(图1)，共有11只山羊和7只绵羊存在多处脓肿，无菌采集每一处脓肿内容物，并记录羊只和样品信息。

A.山羊；B.绵羊

1.5 主要试剂5%绵羊血琼脂培养基为西北农林科技大学动物医学学院重大疫病综合防控与净化团队自制；细菌DNA提取试剂盒购自天根生物公司；引物合成和基因测序由西安擎科泽西生物技术有限公司完成；2×Taq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker购自北京迪宁生物科技有限公司。

1.6 细菌分离培养将样品运送至实验室后，对含样品的离心管表面消毒，于超净工作台内使用无菌接种环蘸取1环采集的脓肿内容物，三区划线接种于5%绵羊血琼脂培养基，在电热恒温培养箱中(36±1)℃培养48 h，之后挑取单菌落接种于血琼脂培养基使用相同培养条件进行纯化培养。

1.7 细菌16S rRNA基因PCR扩增和测序鉴定经纯化培养后的细菌挑取单菌落，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因PCR扩增通用引物[12]27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR。反应体系为20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 10 μL，模板2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O补至20 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。

扩增产物约为1 356 bp，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后送至擎科泽西生物技术有限公司测序，获得序列后登录NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对，以此确定分离菌株信息，记录每份样品中所获得的细菌种类和数量。

2 结果

2.1 体表脓肿发病率经对山羊和绵羊养殖场中羊体表CLA样脓肿的发病率进行统计，结果显示：山羊发病率为0.3%～9.5%，平均发病率为1.8%；绵羊发病率为0.2%～10.1%，平均发病率为1.9%。每个养殖场发病率结果统计见表1，2。

表1 山羊体表脓肿发病率统计

表2 绵羊体表脓肿发病率统计

2.2 脓肿样品细菌分离鉴定分离菌DNA样品经PCR扩增、PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，均出现与预期大小一致的目的片段(图2)。PCR产物经16S rRNA基因测序比对鉴定，结果显示脓肿样品中分离的菌株以金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌为主(图3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.阳性对照；2.金黄色葡萄球菌；3.伪结核棒状杆菌；4.化脓隐秘杆菌；5.鞘氨醇单胞菌；6.链球菌；7.多杀性巴氏杆菌；8.阴性对照

山羊源135份样品中，获得69株金黄色葡萄球菌，其中62株为单一种类存在，7株为与其他细菌混合存在；获得伪结核棒状杆菌42株，其中35株伪结核棒状杆菌为单一种类存在，7株为与其他细菌混合存在；获得16株化脓隐秘杆菌，其中10株为单一种类存在，6株为与其他细菌混合存在；获得鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)7株，链球菌(Streptococcus)4株，绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)和迪茨细菌(Dietzia)各1株。每个养殖场样品中细菌分离鉴定结果如下(表3)。

表3 山羊脓肿样品细菌分离鉴定结果

绵羊源107份样品中，未获得伪结核棒状杆菌；获得金黄色葡萄球菌82株，其中77株为单一存在，5株为与其他细菌混合存在；获得化脓隐秘杆菌22株，其中20株为单一存在，2株为与其他细菌混合存在；获得腔隙莫拉菌(Moraxellalacunata)2株，多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、链球菌(Streptococcus)、羊创伤球菌(Helcococcusovis)、鼠鼻罗氏菌(Rothiamuridae)和不动杆菌(Acinetobacter)各1株。每个养殖场样品中细菌分离鉴定结果如下表(表4)。

表4 绵羊脓肿样品细菌分离鉴定结果

2.3 脓肿样品中细菌分离率统计共采集242份山羊和绵羊体表脓肿内容物样品，经细菌分离鉴定，对不同细菌在羊源体表脓肿样品中的总分离率及山羊和绵羊中各自分离率分别予以统计，结果显示：山羊体表脓肿样品中，按分离率由高到低依次为金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌和链球菌等其他细菌；绵羊体表脓肿样品中，按分离率由高到低依次为金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和其他细菌，未分离到伪结核棒状杆菌。结果统计如下(表5，图2)。

表5 羊脓肿样品细菌分离率统计

2.4 体表多处脓肿样品细菌分离鉴定体表有多处脓肿的11只山羊中，脓肿数量为2～5个；对11只山羊每处脓肿的样品细菌分离鉴定结果显示，山羊体表多处脓肿中分离的细菌包含金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌和化脓隐秘杆菌等3种细菌，其中有6个个体每处脓肿分离的细菌种类一致且均为金黄色葡萄球菌，而其余5个个体多处脓肿分离的细菌种类表现为不一致；体表有多处脓肿的4只绵羊中，脓肿数量为2～4个，每只绵羊体表多处脓肿中分离的细菌种类一致，且均为金黄色葡萄球菌。脓肿样品来源和细菌分离鉴定结果如表6。

图4 羊源脓肿样品中细菌分离率

表6 单只羊多处脓肿的病原分离鉴定统计

3 讨论

近年来，随着我国羊产业的快速发展，羊CLA的防治工作备受关注。而国内学者关于我国CLA的研究，大多集中于对山羊病例的研究[13-16]，关于绵羊该病的报道十分少见。本试验对甘肃省庆阳地区绵羊和陕西省关中地区山羊进行发病率和病原学比较，对于该病的流行病学和病原学研究以及防制措施制定能够提供重要参考依据。

本试验从临床发病羊中采集脓肿组织样品进行细菌分离鉴定，在所有脓肿样品中，细菌分离率由高到低依次为金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌及其他种类细菌，与已有研究结果基本一致。本试验结果表明，在采集的107份绵羊源脓肿样品中，未分离到伪结核棒状杆菌，而135份山羊源样品中伪结核棒状杆菌的分离率为31.1%，说明伪结核棒状杆菌在本次采集的绵羊和山羊CLA样脓肿样品中分离率存在差异，伪结核棒状杆菌可能与甘肃省庆阳地区绵羊CLA样体表脓肿发病无关，伪结核棒状杆菌在我国与国外绵羊的感染现状和分离率可能不一致[17-18]。另外，脓肿样品中分离的金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌和化脓隐秘杆菌绝大部分为单一存在形式，两两混合或者三者混合的存在形式极少，关于该3种病原菌之间是否存在某种未知竞争关系也可能值得研究。绵羊和山羊体表多处脓肿组织中病原分离鉴定结果表明，不同脓肿部位分离的细菌包含金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌和化脓隐秘杆菌等3种细菌，山羊体表每处脓肿分离的细菌既可为同一种细菌(均为金黄色葡萄球菌)，也可为不同种类的细菌，而绵羊每处脓肿组织中分离的细菌种类一致且均为金黄色葡萄球菌，表明金黄色葡萄球菌可能与体表多处脓肿的发生关系密切。鉴于此，关于羊CLA样体表脓肿的科学研究和临床防治，针对金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌开展联防联控研究可能更为科学。

据报道，金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌人工感染动物后，能引发动物出现与伪结核棒状杆菌感染后一致或相近的临床症状与病理变化[19-21]。因此，一方面关于CLA的病原种类，除普遍认知的伪结核棒状杆菌外，可能还应将金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌列入其中；另一方面，从病名角度，或可对于以金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌为主引起的CLA体表脓肿进行统一命名，已有部分学者将其称为“羊皮下脓肿”，而羊皮下脓肿的范畴较为广泛，针对性可能不足；称之为CLA，则将病原种类限定于伪结核棒状杆菌，亦不够合理；本研究中将其称为“羊CLA样脓肿”，可供参考，关于该问题的最终定论，还需更多学者参与研究讨论。