油酸对延边牛前体脂肪细胞分化及成脂相关基因表达的影响

尹云厚，张军芳，郭盼盼，唐 琳，李香子，严昌国，金 鑫

(1.贵州民族大学，贵阳 贵州 550025；2.延边大学 农学院，吉林 延吉 133002；3.延边大学 实验动物中心，吉林 延吉 133002)

肉牛脂肪酸组成对肌内脂肪沉积具有重要影响。油酸是肉牛肌内脂肪组织中含量最丰富、最重要的单不饱和脂肪酸，是发达国家牛肉品质评定体系中最为重要的评价指标之一。研究表明，油酸作为γ-过氧化物酶体激活物受体(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)的天然配体，能够激活PPARγ与视黄醇类X受体形成异源二聚体，调控目的基因的转录，在调节脂质代谢和抗氧化方面有别于其他类型的脂肪酸[1-2]。同时，油酸也是PPARγ的内源性活化剂，可以诱导3T3-L1细胞中甘油三酯的积累[3]，通过调控PPARγ来影响脂肪生成和基因下游产物的表达，可作为诱导促进剂调控前体脂肪细胞的增殖和分化[4]。在延边牛肌内脂肪中，油酸含量越高，肌内脂肪含量也越高。但是，油酸如何调控延边牛脂肪细胞分化并参与脂肪沉积的相关机制目前尚不清楚。因此，本试验利用油酸诱导延边牛前体脂肪细胞分化，通过分析油酸对细胞内脂滴形成、甘油三酯生成及成脂相关基因的表达，研究油酸在脂肪细胞分化过程中的影响；旨在阐明油酸对延边牛前体脂肪细胞分化的影响及其对成脂相关基因的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞试验所用的延边牛前体脂肪细胞由延边大学东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心鉴定并保存。

1.2 主要试剂澳洲胎牛血清FBS、DMEM高糖培养液、0.25%胰蛋白酶EDTA-triypsin、无钙镁磷酸盐缓冲液、链霉蛋白酶、4%多聚甲醛购自Gibco公司；青链霉素混合液、油红O染色试剂盒(G1262)购自Solarbio公司；甘油三酯测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；荧光定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；50×电泳液购自沈阳汇佰生物科技有限公司；CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 牛前体脂肪细胞的诱导分化待传代至第3代的前体脂肪细胞完全汇合后分别进行分化处理，利用分化液(5%FBS/DMEM+油酸100 μmol/L)进行体外诱导分化，5%CO2、37℃恒温培养箱中培养，隔天换1次分化液，分别收集处理0，24，48，72，96，120 h的前体脂肪细胞用于下一步试验，以0 h为对照组。

1.4 生长曲线的绘制待前体脂肪细胞的汇合度达到70%～80%时，用PBS缓冲液轻轻地冲洗3次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，使细胞与胰蛋白酶消化液充分接触后，于37℃恒温培养箱中孵育2 min，取出后，将细胞按一定比例传至96孔板中，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。将20 μL的Cell Titer 96Aqueous One Solution(事先已于室温中静置60～90 min)加入到96孔板的每个小孔中，小心混匀，37℃、5%CO2条件下培养箱中孵育3 h，孵育结束后设置好调零孔，用酶标仪检测各孔D490 nm值，每次取3孔细胞，每隔24 h测定1次，进行MTS测定。

1.5 油红O染色参考油红O染色试剂盒说明书进行。

1.6 RNA的提取及荧光定量PCRTRIzol法提取脂肪细胞mRNA后进行cDNA合成。利用预先设计好的引物(表1)，以GAPDH为内参基因进行荧光定量PCR，具体反应体系参考文献[5]方法进行。

表1 PCR引物序列

1.7 数据分析用Graphpad Prism 6.07统计学软件对基因的相对表达量进行单因素方差分析和多重比较分析并绘制柱形图(P<0.05表示差异显著)。

2 结果

2.1 延边牛前体脂肪细胞的鉴定利用前体脂肪细胞因子基因Pref-1对所分离出的细胞进行鉴定，结果如图1所示，分化后Pref-1的表达不断降低，至分化第6天时，几乎不表达，因此验证所分的细胞为延边牛前体脂肪细胞。

图1 延边牛前体脂肪细胞的鉴定

2.2 油酸对延边牛前体脂肪细胞分化过程中形态变化的影响分化处理开始后，每隔24 h观察1次细胞(图2)。可以看出，分化处理24 h后，形态发生明显变化，未染色条件下便可观察到细胞核周围类似脂滴物质出现；分化72 h时，细胞形态变化更加明显，肉眼可见明显脂滴，说明经油酸处理后的前体脂肪细胞随着培养时间的延长细胞形态不断发生变化。

2.3 油酸对延边牛前体脂肪细胞脂滴形成的影响对不同分化时间的细胞进行油红O染色，结果如图3所示。分化24 h时便可观察到细胞核周围有被染成红色的圆形脂滴出现,随着处理时间的延长，脂滴数量不断增多，大小也不断增大，待120 h时，脂滴密度和大小也变得更大，细胞边界也已变得不再清晰。

图3 不同分化时间油红O染色效果(×200)

2.4 油酸对延边牛前体脂肪细胞的甘油三酯浓度的影响油酸处理后24 h开始，细胞内甘油三酯的浓度逐渐升高，各处理组均高于对照组(图4)，其中，96 h处理组的甘油三酯浓度最高，极显著高于0，24，48 h组(P<0.05)，120 h开始略下降，但与96 h 处理组无显著性差异(P>0.05)。

图4 油酸处理后不同时间的甘油三酯浓度变化

2.5 油酸对延边牛前体脂肪细胞成脂相关基因表达的影响由图5可以看出，经油酸处理后,各成脂相关基因的表达随分化时间不同，各自呈现不同变化趋势，PPARγ基因的相对表达量在诱导开始后显著上升，至48 h时达到最高值(P<0.05)，随后缓慢下降，至96，120 h时已显著低于48 h，但仍显著高于0 h(P<0.05)；C/EBPα、FABP4和PLIN2基因的相对表达量经油酸处理后先逐渐升高，到96 h 时达到最高(P<0.05)，之后开始略下降，但仍显著高于对照组(P<0.05)；LPL基因在诱导开始后先显著下降而后恢复到处理前的水平；C/PT1β和SREBP1基因的相对表达量在油酸处理后不断升高，到120 h时达到最高(P>0.05)；SCD基因在处理24 h开始显著下降(P>0.05)，在120 h时达到最低(P<0.05)。结果表明，在延边牛前体脂肪细胞培养液中加入油酸，对主要成脂相关基因的相对表达量起着不同的调节作用，且随着处理时间的不同，各基因的相对表达量呈现出不同的变化趋势。

图5 不同处理时间成脂相关基因的表达量变化

2.6 油酸对延边牛前体脂肪细胞成脂相关基因蛋白表达的影响对诱导48，96 h的脂肪细胞中成脂标志基因PPARγ和C/EBPα的蛋白表达水平进行检测，如图6所示，PPARγ基因经油酸处理后，48 h时表达量显著升高(P<0.05)，在96 h时显著下降，但仍显著高于0 h组，表现出诱导后先升后降维持高水平表达的趋势，而C/EBPα基因在经油酸处理后，蛋白表达量不断升高，96 h时表达量最高(P<0.05)。Western blot检测条带与mRNA表达规律不完全一致，说明可能存在转录后调控的机制。

图6 成脂关键因子的蛋白表达规律

3 讨论

脂肪酸可分为饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFAs)和不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFAs)。脂肪酸能够通过调节PPARs、肝细胞核因子-4a、肝脏X受体和SREBPs等多种转录因子和核受体参与调节脂肪的生成、代谢效率、胰岛素作用、物质合成和机体组成等多种生物学功能。有研究表明,脂肪酸可参与脂肪细胞的生理功能的调控和脂肪代谢[4-6]。作为PPARγ的天然激动剂，油酸可作为脂肪细胞分化的诱导促进剂[7]。油酸能调节PPARγ、LPL及C/EBPα的表达，促进猪前体脂肪细胞的分化，而且其促细胞分化的能力比12碳、16碳和18碳饱和脂肪酸强[4]。

油酸在人体还发挥着保护心血管、抗炎、抗肿瘤、调节免疫、改善氧化应激等多种重要功能[8-11]。研究表明，OA是牛肌肉和脂肪组织中含量最丰富的脂肪酸[12-14]，脂肪组织质量的增加伴随着OA的相应增加[15-16]。日本黑牛的肌肉OA异常高[12,17],其独特之处在于其在肌筋膜中含有脂肪细胞[18-19]。

大多数关于脂肪细胞分化的研究采用多种诱导物联合对前体脂肪细胞共同作用，也有研究者探索了前体脂肪细胞和成肌细胞在单一添加物添加作用下的成脂分化，通过检测脂肪组织分化(C/EBPβ，PPARγ)和脂质代谢(AMPKα，CPT1β，GPR43，SCD)的标志基因来研究脂肪酸对成脂分化的影响[20-23]。有研究表明，PPARγ的表达受到C/EBPβ的强烈促进，从而启动前体脂肪细胞的分化[24-25]，另外抑制SCD催化活性可降低与脂肪酸合成相关的基因(如脂肪酸合成酶)的活性，同时增加了与脂肪酸氧化相关的基因(如CPT1β)的表达[26-27]。本试验以100 μmol/L的油酸作为诱导分化剂,研究不同处理时间(0,24,48,72,96,120 h)油酸对延边牛脂肪细胞分化过程中的脂滴形成、甘油三酯浓度及成脂相关基因表达的影响，结果表明通过油红O染色，24 h时便可观察到脂滴形成，且随着处理时间的增加，脂滴不断增多、增大，甘油三酯含量也增加；成脂相关基因的相对表达量随处理时间的不同各自呈现出不同的变化，如PLIN2基因在经油酸处理后表达量显著升高。油酸处理后SCD基因的表达显著降低，该结论与已报道的研究结果一致[23]，说明单一添加物油酸即可有效诱导延边牛前体脂肪细胞成脂分化。该诱导方法简单易行，可为后续高通量筛选候选功能基因提供试验材料。

本试验结果表明，油酸可诱导延边牛前体脂肪细胞分化、促进脂滴形成及提高甘油三酯浓度，同时可调控成脂相关基因(PPARγ、C/EBPα、LPL、FABP4、SCD、CPT1β、SREBP1和PLIN2)及蛋白(PPARγ、C/EBPα)的表达。