羊源A型产气荚膜梭菌α毒素基因截短表达及其间接ELISA方法的建立与应用

李 通，孟卫芹，马 力，陈金龙，沈志强,3，王金良*，韩先杰*

(1.青岛农业大学 动物医学院，山东 青岛 266109；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；4.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又称魏氏梭菌，是一种革兰阳性、可以产生芽孢的粗杆状厌氧菌。该菌对营养条件要求较低，广泛存在于空气、水、土壤、食品及动物的胃肠道中，是自然界中常见的条件性致病菌，动物抵抗力下降时即可引起发病[1-3]，其可引起羊肠毒血症、羔羊痢疾、羊猝狙等，严重影响畜禽的健康养殖,同时也对人类健康造成极大威胁[4-5]。研究发现的产气荚膜梭菌外毒素有12种(α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν)，其中最主要外毒素为α、β、ε、ι等4种，根据这4种主要外毒素可将Clostridiumperfringens分为A、B、C、D、E共5种基因型，近年来相关研究又增加了F、G这2种基因型[6-8]。α毒素(cpa)是所有类型产气荚膜梭菌均可产生的细菌外毒素蛋白，是产气荚膜梭菌产生的重要的皮肤坏死性、致死性毒素之一，该毒素同时具有鞘磷脂酶和磷脂酶C 2种酶活性且有毒素活性，其可进入血液循环引起动物败血症或毒血症，从而导致急性死亡[9-10]。

目前，羊三联四防疫苗在羊产气荚膜梭菌的防制过程中起到积极的作用。自繁自养的规模化羊场依据疫苗免疫程序，能够很好地控制该病的发生。异地育肥的羊群，因羊源不同，导致疫苗免疫时间不一致，进而羊群中疫苗抗体的水平参差不齐，时有产气荚膜梭菌病的发生，并造成较大的经济损失，急需一种可以用于疫苗免疫后抗体评价的方法，用于指导疫苗的免疫。本试验成功构建了产气荚膜梭菌α毒素基因原核表达质粒pET32a-α702，通过E.coliRosetta(DE3)大肠杆菌实现了对α毒素基因的截短表达(101 aa～334 aa)。以纯化、复性后的α毒素截短蛋白作为抗原，优化相关条件建立了羊源产气荚膜梭菌 α毒素抗体间接ELISA检测方法，可用于羊群免疫产气荚膜梭菌疫苗后的抗体水平评估，为产气荚膜梭菌病防制及该菌的流行病学调查提供了技术支持和物质保障。

1 材料与方法

1.1 主要试剂DL2000 DNA Marker,购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DL8000 DNA Marker,北京全式金生物公司产品；蛋白Marker、预染蛋白Marker,购自赛默飞公司；PCR Mix、E.coliDH5α、E.coliRosetta(DE3)、pET32a(+)、pMD18-T、T4DNA Ligase、BamHⅠ、SalⅠ,宝生物(大连)有限公司产品；DNA提取与DNA回收试剂盒购、质粒提取试剂盒,购自Omega公司；DAB底物显色液,购自Proteintech公司；TMB单组分显色液,购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗羊HRP-IgG,购自Sigma公司；96孔酶标板,购自BIOFIL公司。

1.2 试验样品A型产气荚膜梭菌(CVCC37)，羊产气荚膜梭菌阴性、阳性血清，口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊痘病毒(SPV)阳性血清，均由本实验室保存；226份临床血清样品，山东羊养殖区收集。

1.3 引物的设计与合成参考GenBank公布的大小为1 197 bp的α毒素基因全序列(MW665544.1)，使用DNAStar对其氨基酸序列的抗原决定簇抗原性进行分析；选择大小为702 bp的基因序列(101 aa～334 aa)，使用Primer 5.0添加酶切位点、保护性碱基进行引物设计。其中上游引物F：TATCGG-GATCCGATACAGATAATAATTTC(下划线部分为BamHⅠ位点)；下游引物R：AAGCTT-GTCGACGAGTGTCTTTACTTC(下划线部分为SalⅠ位点)，引物由通用生物(安徽)有限公司合成。

1.4 α毒素截短基因的克隆将A型产气荚膜梭菌菌株接种液体硫乙醇酸盐培养基，在43℃厌氧条件下培养12 h。使用DNA提取试剂盒提取DNA，以其为模板进行PCR。PCR反应体系(20 μL)：PCR Mix(2×)10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃ 7 min，4℃终止。1%琼脂糖电泳后进行胶回收，连接pMD18-T载体送通用生物(安徽)有限公司测序。将测序结果使用DNAStar软件与参考α毒素基因序列进行比对分析，确认序列正确后使用BamHⅠ、SalⅠ对pMD18-T-α702进行双酶切，获得酶切α702基因片段。

1.5 重组载体的构建与鉴定利用BamHⅠ、SalⅠ双酶切pET32a(+)质粒，1%凝胶电泳后进行胶回收。将酶切回收后的α702基因片段、pET32a(+)质粒使用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态，挑取单菌落摇菌，进行菌液PCR鉴定，提取质粒酶切鉴定获得重组表达载体pET32a-α702。

1.6 重组蛋白的原核表达、纯化及复性pET32a-α702重组质粒转入E.coliRosetta(DE3)大肠杆菌，使用氨苄抗性的LB固体培养基筛选，挑取单菌落摇菌过夜。将菌液按1%接种氨苄抗性LB培养基摇菌至D600 nm=0.6，加IPTG至终浓度100 μmol/L，37℃、180 r/min诱导表达5 h。培养液10℃、8 000 r/min离心3 min，使用PBS重悬菌体并超声破碎，离心保留上清，沉淀使用PBS洗涤1次，离心弃上清，使用8 mol/L尿素溶解沉淀。将上清、沉淀进行12%SDS-PAGE电泳分析。对蛋白溶液使用0.45 μm滤膜过滤，以镍离子亲和层析法进行纯化，纯化的蛋白置于透析袋中，在冰浴条件下使用磁力搅拌器梯度透析。测定纯化蛋白浓度，加入适量甘油置于-40℃冻存备用。

1.7 重组蛋白Western blot鉴定将重组蛋白稀释至1 g/L进行12%SDS-PAGE电泳，按照NC膜表面积(cm2)的5倍确定电流(mA)大小，转膜25 min。以含有5%的脱脂奶粉的TBST Buffer在4℃封闭12 h；用TBST Buffer 清洗3次，每次10 min；加1∶1 000的带辣根过氧化物酶标记的鼠抗His标签抗体在37℃温箱孵育30 min；TBST Buffer清洗3次，每次10 min；DAB底物显色液常温避光显色1 min。

1.8 ELISA方法建立

1.8.1最佳包被质量浓度、包被条件 对纯化蛋白进行梯度稀释(4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mg/L)，在酶标板上添加100 μL/孔，使用4℃ 12 h、37℃ 2 h 2种条件包被。以阴性、阳性血清1∶100，37℃孵育30 min；二抗1∶2 000，37℃孵育30 min；37℃显色10 min进行测试。测定D450 nm/D630 nm(以630 nm 作为参比波长)值，选择P/N值最大为最佳抗原包被质量浓度。

1.8.2最佳样品稀释度、二抗浓度及反应时间 对羊产气荚膜梭菌阴性、阳性血清进行稀释(1∶25,1∶50,1∶100,1∶200,1∶400)添加100 μL/孔，反应时间选择30,40,50,60 min进行测试。对兔抗羊HRP-IgG二抗进行稀释(1∶1 000,1∶2 500,1∶5 000,1∶10 000)添加100 μL/孔，反应时间选择30,40,50,60 min进行测试。测定D450 nm/D630 nm值，选阳性血清D450 nm/D630 nm值在1左右为最佳样品稀释度、二抗浓度及反应时间。

1.8.3最佳显色时间 添加底物液50 μL/孔，以不同显色时间(5,10,15 min)，在37℃下进行显色，测定D450 nm/D630 nm值，分析确定间接ELISA方法的最佳显色时间。

1.8.5敏感性试验 选取羊产气荚膜梭菌阴性、阳性血清进行稀释(1∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600)，使用建立的方法进行检测3次，根据阳性血清的最大稀释倍数评价该间接ELISA方法的敏感性。

1.8.6特异性试验 选择羊产气荚膜梭菌阴性、阳性血清，FMDV、PPRV、SPV阳性血清，用建立的的间接ELISA方法检测，以评价其特异性。

1.8.8临床血清样本的检测 用建立的间接ELISA方法对山东某羊养殖区收集的226份临床羊血清进行检测，以此来评估本地区羊群α毒素抗体水平。从检出的临床阳性血清、阴性血清中各随机选取20份，用产气荚膜梭菌α毒素抗体经典检测方法[11]进行复核检测，被检血清用生理盐水进行2倍稀释后，取0.1 mL与小鼠1个最小致死量的α毒素混合，加生理盐水至终体积0.5 mL，37℃反应2 h后，健康小鼠腹腔注射0.5 mL/只，重复3次；对照组为无菌生理盐水代替稀释后的血清；注射48 h后进行观察记录，若生理盐水对照组全部死亡，血清中和试验组存活小鼠≥2只则判定为血清抗体阳性，存活小鼠<2只则判定为抗体阴性。

2 结果

2.1 重组载体的构建、鉴定PCR产物经1%凝胶电泳可见单一明亮条带，约为702 bp，与预期条带大小相符(图1)。pMD18-T-α702载体测序结果分析，基因序列准确无误。构建的pET32a-α702重组质粒经BamHⅠ、SalⅠ双酶切验证可见约702 bp的目的基因(图2)，表明重组质粒构建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.α毒素基因PCR扩增产物；2.阴性对照

M.DL8000 DNA Marker；1.pET32a(+)的BamHⅠ、SalⅠ双酶切；2.重组质粒的BamHⅠ、SalⅠ双酶切

2.2 α毒素截短基因的原核表达及鉴定12%SDS-PAGE电泳结果表明目的蛋白主要以包涵体形式存在，约为43 kDa，与预测蛋白大小相符(图3)；使用镍离子亲和层析法进行纯化，测定纯化蛋白质量浓度为5.1 g/L(图4)；Western blot结果显示在43 kDa处有特异性条带出现(图5)。

M.蛋白Marker；1.重组菌诱导后沉淀；2.重组菌诱导后上清；3.重组菌诱导前沉淀；4.重组菌诱导前上清；5.空质粒菌诱导后沉淀；6.空质粒菌诱导后上清；7.空质粒菌诱导前沉淀；8.空质粒菌诱导前上清

M.蛋白Marker；1.空白；2.纯化蛋白

M.预染蛋白Marker；1.纯化蛋白与带HRP标记的鼠抗His标签抗体反应；2.空白对照

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1反应条件的优化 根据相关结果筛选最优间接ELISA条件为蛋白包被质量浓度2 mg/L，4℃包被12 h；血清1∶50稀释，37℃孵育40 min；二抗1∶2 500稀释，37℃孵育40 min；37℃显色10 min。

2.3.3敏感性试验 使用建立的方法检测阴性、阳性血清，阳性血清稀释至400倍D450 nm/D630 nm值仍大于临界值，阴性血清D450 nm/D630 nm值始终低于临界值(图6)，表明该方法的敏感性较高。

图6 敏感性试验

2.3.4特异性试验 使用建立的方法对FMDV、PPRV、SPV阳性血清，羊产气荚膜梭菌阴性、阳性血清进行检测，羊产气荚膜梭菌阳性血清检测结果为阳性，其余均为阴性，证明该方法的检测特异性良好。

2.3.5重复性试验 使用建立的方法对8份血清进行检测，批内变异系数在2.57%～7.69%之间(表1)，批间变异系数在4.38%～7.78%之间(表2)，均小于10%，证明该方法的重复性较好。

表1 批内重复性试验

表2 批间重复性试验

2.3.6临床血清样本检测 使用建立的ELISA方法对226份来自山东羊养殖区收集的临床羊血清样本进行检测，结果162份α毒素抗体为阳性、64份为阴性，阳性率为71.68%。随机选取20份阴性血清、20份阳性血清的复核检测中，小鼠毒素中和试验检出血清阳性17份，阴性23份，2种方法符合率92.50%。

3 讨论

羊产气荚膜梭菌病一直以来都是影响羊养殖行业健康发展的重要疾病之一，其发病急、死亡快、难于救治往往给养殖业带来巨大经济损失。近年来,伴随着抗菌药物的广泛应用，产气荚膜梭菌的耐药性日益严重，众多临床毒株逐渐出现了多重耐药性，强毒株的进化与快速适应对羊养殖业和人类健康造成重大威胁[12]。免疫接种是防治羊产气荚膜梭菌病最直接有效的措施，“三联四防”等疫苗在当前羊养殖业中应用广泛、效果显著，但接种疫苗后仍需对羊群免疫效果进行检测评估，并定期进行加强免疫以维持免疫效果[13-14]。

产气荚膜梭菌α毒素是一种依赖于Zn2+的多功能金属酶，其具有细胞毒性、溶血活性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性[15]。该毒素是产气荚膜梭菌致病的一种重要的共有外毒素，其可突破机体的防御屏障，入侵血液循环系统，造成毒血症或败血症，导致患病动物全身衰竭死亡。α毒素作为产气荚膜梭菌各型共有的外毒素，是疫苗制备过程中重要的有效抗原成分，该毒素抗体检测方法的建立在疾病的准确诊断、疫苗免疫效果评价方面具有重要意义，对产气荚膜梭菌病的控制具有重要的指导作用。同批次羊只α毒素抗体的整齐度，可以作为评价羊群感染羊产气荚膜梭菌病的重要参考依据[16-17]。α毒素抗体传统检测方法有小鼠毒素中和试验、卵磷脂水解抑制试验等。小鼠毒素中和试验是检测α毒素抗体的最经典方法，虽然特异性高准确可靠，但费时费力，不便于操作；卵磷脂水解抑制试验敏感性较低，操作繁琐重复性较差，不利于推广使用[18]，并且以上试验均需进行细菌培养获得α毒素，对检测的平台与环境有一定要求。ELISA检测技术具有特异性强、灵敏度高、操作方便、重复性好、检测通量高等特点，检测的数据可进行计算分析，用于辅助疾病的预防控制，且其对检测人员和检测平台无特殊要求，适合各类实验室的应用。

本试验通过对产气荚膜梭菌α毒素基因进行截短原核表达，获得了表达量高，稳定性好的检测抗原，较产气荚膜梭菌活菌培养分离外毒素方法更为简便，适于批量制备。基于原核表达的蛋白建立的产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA方法为羊群产气荚膜梭菌疫苗免疫后抗体水平监测提供了一种便捷、稳定、高效的血清学检测方法，为开展α毒素抗体水平的临床检测提供了技术支持，进一步丰富了产气荚膜梭菌病的综合防控技术。