Linc00996通过调控miR-9-5p抑制小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭

吴 洁 顾 平 孙 茜 刘 政 梁 蝶 牟晨宇（南京市中心医院，南京 210018）

肺癌是全球癌症患者死亡的首要原因，约占所有癌症死亡的22%［1］。小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）约占所有肺癌的15%，具有倍增时间快、生长分数高、早期发生广泛转移等特征，即使SCLC初始化疗和放疗效果较好，但高复发率导致其预后较差，五年生存率不足5%［2-3］。因此，深入研究SCLC的发生机制和治疗靶点对提高患者预后尤为必要。研究发现，Linc00996是多发性骨髓瘤的预后生物标志物，大肠癌中Linc00996呈低表达并与远处转移和不良预后相关，但其在SCLC中的研究尚无报道［4-5］。因此，本研究深入研究Linc00996在SCLC中的分子功能及潜在机制，为SCLC的靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料 人永生化支气管上皮细胞（HBE）及SCLC细胞系（NCI-H446、N69、SHP-77、DMS79、NCIH345）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；miR-9-5p mimic、mimic-NC、pcDNA-Linc00996过表达质粒及阴性对照pcDNA-EGF购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine®3000、Trizol购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit购 自 日 本TaKaRa公 司；miScript SYBR Green PCR Kit购自德国Qiagen公司；ECL试剂盒购自北京Solarbio公司；CCK-8试剂购自Beyotime Institute of Biotechnology公司；微量平板阅读器购自BioTek。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 所有细胞均采用含10%FBS的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2无菌恒温环境中培养，细胞密度达80%左右时进行质粒转染，按照Lipofectamine®3000说明书分别转染miR-9-5p mimic、mimic-NC、oe-Linc00996和oe-NC。

1.2.2qRT-PCR采用Trizol提取细胞总RNA，反转录为cDNA，采用miScript SYBR Green PCR Kit进行qRT-PCR，Linc00996以GAPDH为内参，miR-9-5p以U6为内参，归一化处理后，2-ΔΔCt计算基因相对表达。引物序列miR-9-5p F：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3；R：5′-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3；U6 F：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3；R：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3；Linc00996 F：5'-CTCTGCCACATCGTTCGGTTC-3′；R：5′-CTTCTTACGCTGCCAACTGCTAA-3；GAPDH：F：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；R：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.3Western blot转染48 h后收集细胞，加入适量预冷RIPA裂解液冰上裂解10 min，离心收集总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，取等量蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶电泳（100 V），移至PVDF膜（60 V、120 min），BSA封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，ECL试剂盒发光自显影，化学发光系统成像拍照观察。

1.2.4CCK-8检测细胞增殖能力 将NCI-H446细胞以5×103个/孔（100µl/孔）接种至96孔板，37℃培养过夜，按照分组转染不同质粒24 h、48 h、72 h后，加入10µl CCK-8试剂和90µl新鲜培养基取代细胞培养液37℃继续培养2 h，微量平板阅读器测量450 nm处吸光度。

1.2.5克隆形成实验 采用胰酶将NCI-H446细胞消化为单细胞悬液，2×102个/孔接种至6孔板，37℃培养7 d后形成集落，4%多聚甲醛4℃固定1 h，0.5%结晶紫室温染色30 min，光学显微镜下观察、计数。

1.2.6划痕实验检测细胞迁移 将NCI-H446细胞（5×105个/孔）接种至6孔板，细胞80%融合时采用移液枪枪头在孔平面轻轻划过，PBS洗涤3次，去除游离细胞，加入无血清培养基培养24 h，显微镜下观察0 h和24 h细胞迁移情况并拍照。

1.2.7Transwell侵袭实验 将2×104个细胞悬浮于100µl无血清培养基，接种于预涂Matrigel的小室上部，小室下部加入含10%FBS的800µl RPMI1640培养基，孵育24 h后4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色，奥林巴斯IX70倒置显微镜随机选择5个视野迁移细胞并拍照。

1.2.8双荧光素酶报告实验 构建pmirGLOLinc00996-WT质 粒 和pmirGLO-Linc00996-MUT质粒，以含海肾荧光素酶的pRL-TK载体为内参，细胞培养至70%～80%融合时，分别共转染构建好的野生型质粒和突变质粒、miR-9 mimic及mimic-NC，48 h后收集细胞，加入裂解液，Dual-Luciferase Reporter Assay System检测荧光素酶活性。

1.3统计学分析 所有实验均进行3次平行实验，GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1SCLC细胞系中Linc00996呈低表达qRTPCR检 测SCLC细胞系 中Linc00996表 达，结 果 显示，与HBE相 比，SCLC细 胞 系NCI-H446、N69、SHP-77、DMS79、NCI-H345中Linc00996呈显著低表达（P＜0.001，图1）。选择Linc00996表达最低的NCI-H446细胞系进行后续研究。

图1 qRT-PCR检测SCLC细胞系中Linc00996表达Fig.1 Linc00996 expression in SCLC cell lines detected by qRT-PCR

2.2过表达Linc00996抑制NCI-H446细胞增殖转染oe-Linc00996过表达质粒后，Linc00996表达显著升高（P＜0.001，图2A），CCK-8检测发现过表达Linc00996能够显著抑制NCI-H446细胞增殖（P＜0.001，图2B）。平板克隆实验发现，过表达Linc00996后NCI-H446细胞克隆形成能力显著减弱（P＜0.001，图2C）。

图2 过表达Linc00996抑制NCI-H446细胞增殖Fig.2 Over-expression of Linc00996 inhibits proliferation of NCI-H446 cells

2.3Linc00996抑制NCI-H446细胞迁移 划痕实验发现，过表达Linc00996后，NCI-H446细胞迁移水平显著降低（P＜0.001，图3A），Transwell实验发现过表达Linc00996后NCI-H446细胞侵袭水平显著降低（P＜0.001，图3B）。Western blot结果显示，过表达Linc00996后MMP2、MMP9表达显著降低（P＜0.001，图3C），表明过表达Linc00996后NCI-H446细胞迁移、侵袭水平降低。

Note：Compared with pcDNA-EGF group，***.P＜0.001.

2.4Linc00996靶向调控NCI-H446细胞miR-9-5p表达Starbase数据库发现，Linc00996与miR-9-5p存在结合序列（图4A），qRT-PCR发现，miR-9-5p在SCLC细胞系中呈显著高表达（P＜0.001，图4B）。双荧光素酶实验发现，miR-9-5p+Linc00996野生型组荧光素酶活性被显著抑制（P＜0.001，图4C）。qRTPCR结果显示，过表达Linc00996后miR-9-5p表达显著降低（P＜0.001，图4D），证实Linc00996能够靶向下调NCI-H446细胞miR-9-5p表达。

2.5过表达miR-9-5p可逆转Linc00996对NCI-H446细胞增殖的抑制作用qRT-PCR发现，转染miR-9-5p mimic后，miR-9-5p表达显著增加（P＜0.01，图5A）。CCK-8分 别 检 测control组、pcDNA-Linc00996组、pcDNA-Linc00996+mimic-NC、pcDNA-Linc00996+miR-9-5p mimic组NCI-H446细胞增殖，发现转染miR-9-5p后能够逆转Linc00996对NCI-H446细胞增殖的抑制作用（P＜0.05，图5B）。平板克隆实验也证实转染miR-9-5p能够逆转Linc00996对细胞克隆形成能力的抑制作用（P＜0.001，图5C）。

图5 过表达miR-9-5p逆转Linc00996对NCI-H446细胞增殖的抑制作用Fig.5 Over-expression of miR-9-5p reverses inhibitory effect of Linc00996 on proliferation of NCI-H446 cells

2.6过表达miR-9-5p逆转Linc00996对NCI-H446细胞迁移的抑制作用 划痕实验和Transwell实验发现，同时转染pcDNA-Linc00996和miR-9-5p mimic能够逆转过表达Linc00996对NCI-H446细胞迁移和侵袭的抑制作用（P＜0.001，图6A、B）。Western blot结果显示，同时转染pcDNA-Linc00996和miR-9-5p mimic后MMP2、MMP9表达得到一定程度恢复（P＜0.001，图6C），表明miR-9-5p能够逆转Linc00996对细胞侵袭的抑制作用。

图6 过表达miR-9-5p逆转Linc00996对NCI-H446细胞迁移的抑制作用Fig.6 Over-expression of miR-9-5p reverses inhibitory effect of Linc00996 on migration of NCI-H446 cells

Note：Compared with control group，***.P＜0.001.

3 讨论

SCLC发展迅速，早期即可发生广泛转移，导致患者预后极差。随着免疫治疗技术发展，针对SCLC的免疫治疗研究成为新的热点，且免疫治疗能够使SCLC患者受益［6-7］。因此深入研究SCLC的发生发展机制对SCLC的靶向药物开发具有重要意义。

长链非编码RNA（lncRNAs）是一类长度为200个核苷酸的非编码蛋白质的RNA，能够通过调节转录后修饰广泛参与肿瘤发生发展［8-9］。核lncRNA linc02095可正向调节SOX9转录和mRNA输出，促进三阴乳腺癌恶性进展［10］；SCLC中，ZFPM-AS1能够竞争性结合miR-3612，上调TRAF4表达可促进SCLC细胞增殖和侵袭［11］；Linc00173能够靶向吸附miR-218，调节ETK表达，增强SCLC的化疗耐药性并促进其恶性进展［12］。本研究发现，Linc00996在SCLC细胞中低表达，CCK-8、平板克隆实验、划痕实验及Transwell证实过表达Linc00996能够明显降低SCLC细胞增殖、侵袭及迁移能力。MMP2、MMP9与肿瘤转移密切相关，因此本研究通过Western blot检测MMP2、MMP9蛋白表达，结果显示，过表达Linc00996可降低SCLC细胞侵袭水平，表明Linc00996在SCLC中发挥肿瘤抑制因子作用。

研究报道，LncRNA通过竞争性结合miRNA调控肿瘤发生发展［13-14］。本研究通过Starbase预测Linc00996的靶向miRNA，发现其能够与miR-9-5p、miR-758-3p结合，但研究发现miR-758-3p在非小细胞肺癌、膀胱癌、胃癌等多种肿瘤中发挥抑癌作用［15-17］，与本研究假设不符，因此舍弃miR-758-3p。而miR-9-5p在癌症中发挥促癌作用，因此选择miR-9-5p进 行 后 续 研 究。qRT-PCR发 现，miR-9-5p在SCLC细胞系中高表达，过表达Linc00996能够降低SCLC细胞系中miR-9-5p表达。双荧光素酶实验和qRT-PCR发现，Linc00996能够靶向调控miR-9-5p表达。miR-9-5p在SCLC中表达上调，与本研究结果一致［18］。此外，研究报道，miR-9-5p在前列腺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌中均能够促进肿瘤恶性进展［19-21］。本研究显示，Linc00996能够竞争性吸附miR-9-5p，过表达miR-9-5p能够逆转Linc00996对SCLC细胞增殖、侵袭及迁移的抑制作用，表明过表达Linc00996能够通过靶向下调miR-9-5p表达调控SCLC细胞增殖、侵袭及迁移。

综上，SCLC细胞中Linc00996通过调控miR-9-5p表达进而抑制其增殖、侵袭及迁移，为SCLC免疫治疗提供新的思路。