一种基于植物瞬时表达研制新冠病毒重组蛋白疫苗的方法①

王弘瑞 赵丽娟 房明丽 杨 明（吉林大学基础医学院分子生物学教研室，长春 130021）

新型冠状病毒又称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），是一种单链正股RNA病毒，可引起致命的呼吸道感染，造成肺部炎症，又称新冠肺炎（COVID-19）［1-2］。COVID-19具有传播速度快，潜伏期长，发病率高等特点，对全球范围内的公共卫生和人类生命安全已造成严重的威胁［3-4］。截至目前，COVID-19疫情已经持续了2年多，然而由于COVID-19疫苗的产能不足及病毒的变异特点，世界各地的卫生组织和国家依然处于努力控制COVID-19传播的状态［5］。

SARS-CoV-2表面的刺突（S）蛋白上的受体结合区（receptor binding domain，RBD）能识别宿主细胞膜上的血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme，ACE2）介导病毒入侵宿主细胞，S蛋白对于病毒与细胞受体的结合及与细胞膜的融合均发挥关键作用［6-7］。目前，用于人群接种的几种COVID-19疫苗，均是以SARS-CoV-2的S蛋白作为靶点［8］。如mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗及灭活病毒疫苗等，均能在一定程度上诱导抗S蛋白的中和抗体，阻断SARS-CoV-2对机体的侵染［9］。然而这几种疫苗也表现出了一定的限制性，如mRNA疫苗的成本高且不易保存；腺病毒载体疫苗易引发血栓问题［10］；灭活病毒疫苗的有效性和安全性也有待进一步提高［11］。相比之下，重组蛋白疫苗具有更为平衡的有效性和安全性，且成本较低。对于SARS-CoV-2的重组蛋白疫苗生产的主要问题在于如何选择一种高效且快速的表达系统［12］。

常见的蛋白表达系统有原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统及植物表达系统等。植物的蛋白表达系统相比于传统系统具有很多优点，如高效、快速、低成本及易扩大化生产等［13］。在植物表达系统中，可以根据外源基因所在位置可将植物表达系统分为转基因植物稳定表达以及植物瞬时表达系统［14］。尽管转基因植物有稳定转化的优点，但生产稳定表达的转基因植物品系费时费力，而且生物安全法规也禁止在野地中种植转基因植物［15］。因此，采用植物瞬时表达系统来表达蛋白则是一种更为快速有效的方法。目前比较成熟的方法是利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）将外源质粒DNA渗透到植物细胞中进行快速表达［16］。采用农杆菌渗透法不仅可在短时间内获得非常高的蛋白质积累，而且还消除了环境污染的风险［17］。因此，基于植物瞬时表达系统的高产、快速和生物安全性等特点，其成为了基础研究和重组蛋白疫苗工业化生产等多种应用的最佳选择之一。

利用农杆菌渗透法可以将目的基因导入到植物细胞中进行瞬时表达。本氏烟草（Nicotiana benthamiana）因其具有全面的生物学特性、产量高、多种表达载体相容性好以及易渗透等优点，可作为瞬时表达重组蛋白的首选植物［18］。采用上述方法进行瞬时表达的蛋白质通常会在农杆菌渗透后4～8 d达到积累高峰。此后，通过收获植物叶片，从中提取目的蛋白并进行纯化［19］。而纯化的重组蛋白疫苗进一步通过生化和免疫学鉴定后，可在动物模型中进行功能检测来评估其有效性［20］。本研究设计一种采用本氏烟草来瞬时表达的SARS-CoV-2 S重组蛋白疫苗生产方案，并对此过程和结果进行了详细阐述。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验试剂SARS-CoV-2 S重组蛋白基因的根癌农杆菌GV3101菌株购自北京博迈生物有限公司，质粒系自行构建；羧苄青霉素（Carbenicillin）和利福平（Rifampicin）均购自北京博奥拓达科技有限公司；酵母提取物营养肉汤（YenB）培养基（0.75%酵母提取物和0.8%营养肉汤，pH=7.0）、琼脂粉均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液（pH=5.5）购自美国Sigma公 司；PBS缓 冲 液（pH=5.2）、苯 甲 基 磺 酰 氟（PMSF）、镍离子金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）、葡聚糖凝胶G-25、咪唑缓冲液、His-tag抗体、Sepharose和sephedex-G25层析介质均购自美国GE Healthcare公司。本氏烟草植物种子由吉林大学农学部刘金亮教授馈赠；育苗块购自寿光益园中科农资公司）；水溶性肥料购自春天农资公司；育苗盒购自苏州纯氧园艺设施公司。

1.1.2实验仪器及场地721s可见光分光光度计（Lengquang Tech公司）；台式恒温振荡器（上海习仁科学仪器有限公司）；人工气候植物培养室（博易智汇科技北京有限公司建造）；匀浆机（上海净信实业发展有限公司）；离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1植物烟草的培养 将育苗块置于育苗盒中，加入约2 L去离子水，浸泡2 h，使育苗块完全吸水膨胀。向育苗块的中心播种2～4粒本氏烟草种子，并添加去离子水至育苗块底部约1/4处，然后将育苗箱放置于人工气候培养室中，恒温25℃，相对湿度60%～80%，16 h/8 h的光照条件。约3周后，去除育苗盒盖，加入2 L（浓度为1.48 g/L）的水溶性肥料继续培养，在后续生长过程中，保持每2～3 d施肥1次。当烟草植物在生长第5周时，选择5片生长旺盛且分布均匀的叶片留下，并摘除其他叶片。当烟草生长到第6周时，叶片生长到接近手掌大小，可用于下一步的农杆菌渗透。

1.2.2SARS-CoV-2 S重组蛋白农杆菌渗透液的制备 构建并培养包含SARS-CoV-2 S重组蛋白编码基因的农杆菌，制备农杆菌渗透液。首先，构建包含SARS-CoV-2 S重组质粒的农杆菌：将SARS-CoV-2 S蛋白N末端区域（NTD）中的部分片段与RBD融合，并在其C段加入His-tag便于纯化，随后将该融合蛋白的编码基因连接到MagnICON植物瞬时表达载体中，并转化入农杆菌GV3101中，从而获得含有的目的基因的农杆菌。

将携带有目的基因的农杆菌菌株接种于含羧苄青霉素（100 µg/ml）和利福平（333 µg/ml）的5 ml YenB液体培养基中，30℃以200 r/min的条件摇床培养24 h，直到OD600达到1.0。次日，将5 ml菌液接种于新的100 ml YenB液体培养基中继续培养约16 h，使其OD600值达到1.5～1.8。收集菌液，6 000 g离心15 min，弃上清，得到细菌沉淀，10 ml pH=5.5的MES缓冲液重悬细菌沉淀，并测量其OD600值。根据其OD600值用MES缓冲液进一步稀释。

1.2.3农杆菌渗透烟叶瞬时表达SARS-CoV-2 S重组蛋白 需提前12 h左右将待渗透的烟草转移到普通室温环境下，叶片轻度脱水有助于液体的渗透。随后，将制备好的农杆菌渗透液倒入烧杯中，每次用注射器吸取大约10 ml的农杆菌液用于渗透。选择待渗透的目标叶片，用针头轻轻在叶片上刺穿1个小孔，然后将注射器的喷嘴对准小孔，缓慢推动注射器，让叶片慢慢吸收渗透液。此外，可以在叶子上挑选多个位点来进行渗透，以达到将叶片完全渗透的目的。完成渗透后，添加去离子水至育苗块底部约1/3处，随后将育苗盘放回植物培养室，并监测烟草叶片的生长状况。

1.2.4SARS-CoV-2 S重组蛋白的分离、纯化及鉴定 需要从渗透后的烟叶中提取和纯化SARS-CoV-2 S重组蛋白，并进行初步鉴定。烟叶中SARS-CoV-2 S重组蛋白的粗提：收获渗透后第7天的烟叶，去除叶茎，留下两侧的叶片。将叶片和1.5倍体积的匀浆液（含2 mmol/L PMSF的PBS，pH=5.2）倒入匀浆机中，高速搅拌约2 min。接下来，将叶片匀浆液经棉质纱布过滤转移入250 ml离心桶中，过滤过程需小心用纱布包裹匀浆，轻轻挤压。将收集的过滤液在4℃下离心30 min（15 000 g），离心2次，随后调整pH=5.2，4℃冰箱中过夜，此过程是基于等电点沉淀法来沉淀植物蛋白核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）。接下来，同样的离心条件去除沉淀后的RuBisCO，将上清液pH值调回到7.0，再次离心处理。最后将离心获得的上清液经0.45µm的过滤器处理，获得粗步提纯的SARS-CoV-2 S重组蛋白液。SARS-CoV-2 S重组蛋白纯化与鉴定：将粗步提纯的SARS-CoV-2 S重组蛋白液经过镍离子亲和层析柱，基于镍离子与带His-tag蛋白的结合来进行纯化；接下来，对洗脱的蛋白进一步采取分子筛层析（Sephedex G-25）去除咪唑等小分子，最后，对纯化的SARS-CoV-2 S重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。

2 结果

2.1植物烟草的获得 培养烟草可以为农杆菌的渗透提供健康叶片，用于重组蛋白的表达。如图1A、B所示，将育苗箱放置于人工气候培养室中，维持在恒温25℃，相对湿度为60%～80%，16 h/8 h的光照条件。约3周后，去掉育苗盒盖，保持每2～3 d施肥1次，如图1C所示。当烟草生长到第6周时，叶片生长到接近手掌大小，如图1D所示，可用于下一步的农杆菌渗透。

图1 人工气候室中植物烟草的培育过程Fig.1 Cultivation process of tobacco plants in artificial climate chamber

2.2获得SARS-CoV-2 S重组蛋白农杆菌渗透液构建 如图2所示构建SARS-CoV-2 S重组蛋白疫苗的农杆菌。一般来说，用于渗透叶片的单一农杆菌的OD600≤0.1。通过上述流程成功获得可用于表达SARS-CoV-2 S重组蛋白的农杆菌渗透液。

图2 构建SARS-CoV-2 S重组蛋白疫苗的农杆菌示意图Fig.2 Schematic diagram of Agrobacterium tumefaciens for constructing SARS-CoV-2 S recombinant protein vaccine

2.3农杆菌渗透烟叶瞬时SARS-CoV-2 S重组蛋白的表达 采用注射渗透法，将SARS-CoV-2 S重组蛋白农杆菌注射到烟叶中，来表达目的蛋白（如图3），叶子呈现出了更深的颜色，表面烟叶已成功完成渗透。在小规模的实验室中，常用的农杆菌渗透法为注射渗透法，它可植物叶片的多个位点进行渗透，使植物叶片的利用率更高。该方法可在短时间内获得非常高的蛋白质积累。

图3 农杆菌注射渗透法过程Fig.3 Syringe-infiltration process of Agrobacterium tumefaciens

2.4分离、纯化及鉴定SARS-CoV-2 S重组蛋白将粗步提纯的SARS-CoV-2 S重组蛋白液经过镍离子亲和层析柱，对洗脱的蛋白进一步采取分子筛层析最终获得纯化后的目的蛋白，见图4A。对纯化的SARS-CoV-2 S重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析，结果如图4B、C，采用植物烟草成功的表达SARS-CoV-2 S重组蛋白，其分子量约为53.2 kD，显示His-tag抗体可以很好地识别SARS-CoV-2 S重组蛋白。

图4 SARS-CoV-2 S重组蛋白的纯化及SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 Purification of SARS-CoV-2 S recombinant protein and SDS-PAGE with Western blot analysis

采用植物烟草瞬时表达SARS-CoV-2 S重组蛋白可快速获得大量所需的目的蛋白，产量约为500µg/g新鲜叶片，表达量远高于常见的哺乳动物表达系统。

3 讨论

目前，用于重组蛋白生产的表达系统有很多，但各有其优缺点。比如，原核表达系统表达的蛋白质缺乏足够的翻译后修饰，常影响蛋白疫苗的免疫原性；而酵母、昆虫及哺乳动物细胞表达系统在进行大量蛋白生产时，需投入大量资金来完善其基础设施，从而增加了成本［21］。本研究介绍的基于植物的瞬时蛋白表达系统对于原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统等传统表达系统而言，具有多种优点，如高效、快速、低成本、不携带动物病原体及易扩大化生产等［22］。同时，植物表达系统还可对蛋白质进行必要的翻译后修饰，有助于维持蛋白质的结构稳定和正常功能。此外，随着瞬时表达载体技术的飞跃发展，植物瞬时表达系统的灵活性和生产速度是哺乳动物或昆虫细胞表达系统所无法比拟的。

表达载体的选择是植物瞬时表达系统中非常关键的一环。近年来基于“解构病毒”策略研发的植物病毒表达载体因其能快速生产高水平重组蛋白的优势而备受青睐。此外，“解构病毒”载体在提高生物安全性，降低环境风险等方面也有一定的优势［23］。常用的“解构病毒”载体包括“MagnICON”和“Geminiviral”等。“MagnICON”载体是一种基于烟草花叶病毒和马铃薯X病毒基因组序列的RNA复制载体。为了在植物中瞬时表达重组蛋白，需要将目的基因克隆到“MagnICON”载体中，然后将这种携带目的基因的植物病毒载体转化入根癌农杆菌中［24］。既往研究表明，采用“MagnICON”植物病毒载体进行瞬时表达，每克新鲜叶片可以在接种后的4～8 d内生产出多达5 mg的重组蛋白，是目前已知的植物表达水平最高的一种“解构病毒”载体［25］。因此，植物瞬时表达系统快速且高效表达蛋白的能力使其有望成为生产突发传染性疾病如SARS-CoV-2蛋白类疫苗的表达系统之一。