芍药苷通过抑制NLRP3炎症小体活化减轻病毒性心肌炎小鼠心肌损伤

陈家显 陈 磊 张远生 刘先霞 陈劲松（海南医学院第二附属医院心血管内科，海口 570311）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由嗜心性病毒引发的心肌局限或弥漫性炎症性病变，是一种复杂的儿童获得性心血管系统疾病，近年来发病率呈明显上升趋势［1］。目前VMC的发病机制尚未完全明确，但有研究显示，VMC的发生、发展过程与病毒感染后机体炎症通路激活密切相关［2］。NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体是免疫反应的重要组成部分，与心血管疾病关系密切。众多研究已证实，NLRP3炎症小体的激活参与心肌病和心律失常等疾病的发生发展过程，提示NLRP3炎症通路可能成为VMC治疗的新靶点［3-4］。目前VMC的临床治疗以辅助支持疗法和抗病毒治疗为主，但效果并不理想，因此急需寻找能有效抑制VMC的药物。随着现代药物提取工艺和科学技术的飞跃发展，中药相关单体在抗病毒、防止心脏重构、免疫调节方面取得较大成就［5］。芍药苷（paeoniflorin，PF）是传统中药芍药的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫调节等功能［6］。既往研究表明，PF具有减轻心肌肥厚、抑制心肌纤维化、减少心肌炎症反应、改善左室功能、促进心室重构等作用，但目前关于PF在VMC中作用的研究甚少［7-8］。本研究拟采用柯萨奇B3（coxsackievirus B3，CVB3）病毒感染构建VMC小鼠模型，研究PF对VMC的保护作用，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物60只SPF级雄性BALB/c小鼠，6～7周龄，体质量18～22 g，由湖南省实验动物中心提供，动物合格证编号：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2主要试剂与仪器PF（纯度≥98%，批号：190301）购自成都曼思特生物科技有限公司；CVB3嗜心肌Nancy标准株购自美国标准菌种保存中心（ATCC）；单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）购自法国InvivoGen公司；TUNEL染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物公司；Cleaved caspase-3、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）和GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝公司；心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白（Mb）购自上海索莱宝生物科技有限公司；IL-1β、IL-18和TNF-α ELISA检测试剂盒购自美国R＆D公司。

1.2方法

1.2.1动物造模及分组处理60只BALB/c小鼠随机分成空白对照组（blank）、VMC模型组（VMC）、PF低剂量组（PF-L，10 mg/kg）、PF高剂量组（PF-H，40 mg/kg）和高剂量PF联合NLRP3激动剂组（PF-H+MSU，40 mg/kg PF+5 mg/kg MSU），每组12只。采用腹腔注射0.1 ml 100 TCID50的CVB3病毒溶液建立病毒性心肌炎小鼠模型［9］，次日开始腹腔注射给药，给药体积为0.25 ml，对照组和模型组注射等量生理盐水，1次/d，连续给药7 d。7 d后眼球取血，分离血清后储存于-80℃冰箱待检。采血后颈椎脱臼法处死小鼠，留取心脏组织，取部分组织置于4%多聚甲醛固定，其余组织置于液氮中保存。

1.2.2HE染色观察心肌损伤情况 收集各组小鼠心肌组织，经生理盐水洗净后用4%多聚甲醛固定，经包埋后行石蜡切片，HE染色后光镜下观察心脏组织炎症细胞浸润情况。

1.2.3TUNEL染色观察心肌组织细胞凋亡情况

收集各组小鼠心肌组织，包埋后进行石蜡切片，常规脱蜡，PBS漂洗，加蛋白酶K室温下水解20 min，加蒸馏水洗，3%过氧化氢室温下反应5 min，PBS漂洗3次。加TUNEL反应液，于37℃湿盒中避光孵育60 min，PBS漂洗3次，加过氧化物酶标记的抗体，湿盒中室温孵育30 min，PBS漂洗3次，加显色液，室温反应5 min。蒸馏水洗，脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野，心肌细胞凋亡率（%）=凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.2.4ELISA法检测心肌损伤标志物及炎症因子 收集各组小鼠血清和心肌组织，心肌组织匀浆离心后收集上清液，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值，根据标准曲线计算血清中心肌损伤标志物cTnⅠ、CKMB、Mb及心肌组织中IL-1β、IL-18和TNF-α含量。1.2.5Western blot检测蛋白表达 取适量心肌组织，加入RIPA裂解液充分研磨匀浆至液体状态，12 000 r/min离心25 min，收集上清液，BCA法测定上清液中总蛋白含量。取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入相应的一抗抗体稀释液（Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、caspase-1、GAPDH，1∶1 000），4℃过夜孵育，次日加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h。最后加入发光液于凝胶成像仪进行曝光拍照，利用Image J图像分析软件进行分析，以目的条带与GAPDH的灰度值比值，作为目的蛋白表达的相对水平。

1.3统计学分析 通过SPSS22.0软件进行处理，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两组内比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1PF对VMC小鼠体质量及状态的影响 如表1所示，blank组、VMC组、PF-L组、PF-H组和PF-H+MSU组小鼠在饲养1 d、3 d、5 d、7 d期间体质量均呈逐渐上升的趋势，但在5 d、7 d时VMC组、PF-L组和PF-H+MSU组小鼠体质量显著低于blank组，同时出现皮毛无光泽、活动减少、蜷缩驼背等委顿症状。

表1 各组小鼠体质量比较（±s，n=12，g）Tab.1 Comparison of body weight of mice in each group（±s，n=12，g）

表1 各组小鼠体质量比较（±s，n=12，g）Tab.1 Comparison of body weight of mice in each group（±s，n=12，g）

Note：-1 d.The day before inoculation of the virus；0 d.The day of virus inoculation.1）P＜0.01 vs blank group.

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2.2PF对VMC小鼠心肌组织损伤的影响 如图1所示，blank组小鼠心肌细胞结构正常，排列规则，未见炎症细胞浸润；VMC组、PF-L组和PF-H+MSU组小鼠心肌细胞结构破坏严重，细胞排列紊乱，伴随大量炎症细胞浸润；PF-H小鼠心肌细胞结构基本完整，细胞排列大致有序，有少量炎症细胞浸润。

图1 各组小鼠心肌组织病理学观察（HE染色，×200）Fig.1 Histopathological observation of myocardium of mice in each group（HE staining，×200）

2.3PF对VMC小鼠血清中心肌损伤标志物含量的影响 如图2所示，与blank组比较，VMC组小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量显著增加（P＜0.01）；与VMC组比较，PF-H组小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量显著减少（P＜0.01），PF-L组无显著变化（P＞0.05）；与PF-H组比较，PF-H+MSU组小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量显著增加（P＜0.01）。

图2 各组小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比较Fig.2 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum of mice in each group

2.4PF对VMC小鼠心肌组织中炎症因子含量的影响 如图3所示，与blank组比较，VMC组小鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和TNF-α含量显著增加（P＜0.01）；与VMC组比较，PF-H组小鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和TNF-α含量显著减少（P＜0.01），PF-L组无显著变化（P＞0.05）；与PF-H组比较，PF-H+MSU组小鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和TNF-α含量显著增加（P＜0.01）。

图3 各组小鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和TNF-α含量比较Fig.3 Comparison of contents of IL-1β，IL-18 and TNF-α in myocardium of mice in each group

2.5PF对VMC小鼠心肌组织细胞凋亡的影响

如图4所示，与blank组比较，VMC组小鼠心肌组织细胞凋亡率显著提高（P＜0.01），心肌组织中Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上升（P＜0.01）；与VMC组比较，PF-H组小鼠心肌组织细胞凋亡率显著降低（P＜0.01），心肌组织中Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），PF-L组

图4 各组小鼠的心肌组织细胞凋亡情况比较Fig.4 Comparison of apoptosis of myocardial tissue cells of mice in each group

无显著变化（P＞0.05）；与PF-H组比较，PF-H+MSU组小鼠心肌组织细胞凋亡率显著增加（P＜0.01），心肌组织中Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上升（P＜0.01）。

2.6PF对VMC小 鼠 心 肌组 织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平的影响 如图5所示，与blank组比较，VMC组小鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与VMC组比较，PF-H组小鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），PF-L组无显著变化（P＞0.05）；与PF-H组比较，PF-H+MSU组小鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。

图5 各组小鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平比较Fig.5 Comparison of protein expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in myocardium of mice in each group

3 讨论

VMC的发病机制十分复杂，多认为与病毒直接损伤心肌组织以及机体自身不恰当的免疫反应相关，越来越多的研究表明，NLRP3炎症小体参与了VMC的发病过程：魏傲等［10］研究发现，VMC患者外周血中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平显著升高，推断VMC的发生可能与NLRP3炎症小体的活化有关；WANG等［11］研究进一步发现，抑制NLRP3炎症小体激活能减轻VMC模型小鼠心肌炎症损伤，有效改善VMC模型小鼠心功能。提示NLRP3炎症小体可能是VMC过程中一个极其重要的炎症致病通路，也是一个可能潜在治疗靶点。近些年天然产物在改善心肌损伤及减轻氧化应激和炎症反应方面的积极作用被越来越多的学者关注，PF是中国传统中药芍药中的主要活性成分，现已广泛应用于治疗心脑血管疾病，但PF在VMC中是否具有治疗效果目前还未见报道。本研究结果显示，PF能够显著减少VMC小鼠心肌组织内炎症细胞浸润，下调血清及心肌组织炎症因子含量，从而抑制心肌组织细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制NLRP3炎症小体通路的激活来实现的。

局限性和弥散性的心肌组织坏死、炎症细胞浸润是VMC过程中典型的病理变化，本研究中HE染色结果显示，VMC模型小鼠心肌组织结构破坏，伴有大量炎症细胞浸润，与既往研究一致，提示CVB3诱导的VMC小鼠模型构建成功［12］。给予高剂量PF治疗后，小鼠心肌组织病理损伤明显减轻，心肌细胞排列趋于规则，炎症细胞浸润明显减少。cTnⅠ、CK-MB和Mb为心肌损伤特异性标志物［13］，正常情况下cTnⅠ以复合物或游离状态存在于心肌细胞中，当心肌细胞受损时，cTnⅠ会被释放到血液中，使其在血液中的含量异常升高；CK-MB是心肌中重要的能量调节酶，VMC发生时快速进入血液，其在血液中的含量能特异地反映心肌受损程度；Mb具有贮存和运输氧的功能，心肌损伤时血液中的Mb会迅速升高，众多研究显示，VMC过程中cTnⅠ、CKMB和Mb含量会明显上升［14-15］。本研究结果显示，与正常对照组比较，VMC模型小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量显著升高，高剂量PF治疗能显著降低其水平，说明PF能有效缓解CVB3造成的心肌损伤。

病毒感染造成心肌细胞死亡是导致心肌炎患者心脏功能减退的主要原因，当病毒侵袭心肌细胞时，机体一方面可激活凋亡程序，通过牺牲感染细胞达到清除病毒的作用；另一方面，病毒也可调控凋亡相关基因的表达，调控心肌细胞的凋亡［16］。本研究中TUNEL检测结果显示，与正常组对照比较，VMC模型小鼠心肌细胞凋亡率明显增高，心肌组织中Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上调，与LI等［17］研究发现一致，而高剂量PF治疗组心肌细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平均明显下调，说明PF能通过抑制VMC模型小鼠心肌细胞凋亡，发挥对心肌组织的保护作用。

NLRP3炎症小体是由NLRP3蛋白、ASC和caspase-1组成的大分子多蛋白复合体，通常情况下，机体NLRP3活性处于抑制状态，当NLRP3受外界刺激被激活时，活化的效应蛋白caspase-1可促进IL-1β和IL-18的成熟与释放，加剧炎症反应，参与VMC的发生发展［18］。为进一步探究PF改善VMC小鼠心肌损伤的作用机制，本研究对心肌组织中NLRP3炎症小体通路相关蛋白表达水平以及炎症因子含量进行了检测，研究结果显示，与正常对照组比较，VMC模型小鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平以及IL-1β、IL-18和TNF-α含量显著增加，高剂量PF治疗能显著降低其在心肌组织中的含量，但PF和NLRP3激动剂联合治疗后，PF抑制NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平以及IL-1β、IL-18和TNF-α水平的作用降低，提示PF可能通过抑制NLRP3炎症小体活化减轻VMC小鼠心肌损伤。

综上所述，PF可通过抑制NLRP3炎症小体活化，减轻VMC小鼠心肌细胞炎症反应，减少心肌细胞凋亡，改善CVB3造成的心肌组织损伤，该研究结果可为VMC临床治疗药物的研发提供实验依据。