地佐辛通过上调miR-204-3p减轻LPS诱导的心肌细胞H9C2损伤

鲁美静 文怀昌 汪 懿 王梦丽 张恺辰 陈永权

（安徽省芜湖市皖南医学院弋矶山医院麻醉科，芜湖 241000）

1 材料与方法

1.1材料 大鼠心肌细胞系H9C2（上海越研生物科技公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；RPMI1640培养基、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、LipofectamineTM2000试剂盒、Annexin VFITC/PI细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；PCR引物、miR-204-3p抑制剂（anti-miR-204-3p组）及抑制剂阴性序列（antimiR-NC，上海生工生物工程有限公司）；逆转录试剂盒和PCR试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）；兔抗鼠细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽还原酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 复苏H9C2细胞，采用含10%FBS的RPMI1640培养基培养。取对数生长期H9C2细胞以1×105个/孔接种于6孔板，采用LipofectamineTM2000脂质体法分别转染anti-miR-204-3p、anti-miR-NC，6 h后更换培养基再培养24 h，收集细胞备用。

1.2.2细胞分组处理 未转染细胞分为对照组（Con组）、LPS组和不同剂量（4、8、16 µmol/L）地佐辛组，其中Con组细胞用常规培养基培养，LPS组细胞用含1µg/ml LPS的培养基培养，不同剂量地佐辛组细胞分别用含4、8、16 µmol/L地佐辛与含LPS的培养基共同培养［5］。转染anti-miR-NC、anti-miR-204-3p的细胞均用含16 µmol/L地佐辛和1 µg/ml LPS的培养基共同培养，分别记为16 µmol/L地佐辛+anti-miR-NC组 和16 µmol/L地 佐 辛+anti-miR-204-3p组。

1.2.3CCK-8检测细胞增殖 将细胞以5×103个/孔接种于96孔板，按1.2.2分组处理。培养24 h后，加入10µl CCK-8溶液孵育2 h，酶标仪检测450 nm处光密度（OD）值。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡情况 将细胞以

2.5×104个/孔接种于24孔板，按1.2.2分组处理。培养24 h后收集细胞，PBS清洗2次。参照AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒说明书，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5Western blot检测CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达 将细胞以2.5×104个/孔接种于24孔板，按1.2.2分组处理。培养24 h后收集细胞，PBS清洗2次，加入RIPA试剂提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，分别置于CyclinD1（1∶500）、p21（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶1 000）一抗孵育液中4℃孵育过夜，置于山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育液中7℃孵育1 h，加入显影液避光显影，曝光拍照。

左达边笑边摇头，“没时间了，离开这是非之地，你转告张仲平，如果有来世，我会和他成为最好的朋友，现在，在我跳楼之前，你，快滚！”

1.2.6试剂盒检测LDH、MDA、SOD和GSH-Px水平 将 细胞以2.5×104个/孔接 种 于24孔 板，按

1.2.2分组处理。培养24 h后收集细胞上清和细胞，将上清3 500 r/min离心10 min，保留上清，按照LDH试剂盒说明书检测上清中LDH水平。细胞中加入细胞裂解液充分裂解，3 500 r/min离心10 min，保留上清，参照MDA、SOD和GSH-Px试剂盒说明书检测其水平。

1.2.7RT-qPCR检测miR-204-3p表达 将细胞以

2.5×104个/孔接种于24孔板，按1.2.2分组处理。培养24 h后收集细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增。扩增条件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35个循环。引物序列为miR-204-3p F：5'-GTTTGCTGGGAAGGCAAAG-3'，R：5'-TGTTTTGCTGGGAAGGCAAA-3'；内参U6 F：5'-GTCCAAGGCGCTAGAGCGCAGCT-3'，R：5'-CGAATGCTAAGGCTCTCGAC-3'。2-ΔΔCt法计算miR-204-3p相对表达。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件分析数据，计量资料以xˉ±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞增殖和凋亡的影响 与Con组比较，LPS组H9C2细胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05），细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达升高（P＜0.05）。与LPS组比较，不同剂量地佐辛组H9C2细胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05），细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性（P＜0.05，图1、表1）。

表1 地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=3）Tab.1 Effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

表1 地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=3）Tab.1 Effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with 4 µmol/L dezocine group，3）P＜0.05；compared with 8µmol/L dezocine group，4）P＜0.05.

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图1 地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞凋亡及增殖、凋亡相关蛋白表达的影响Fig.1 Effect of dezocine on LPS-induced H9C2 cells apoptosis and expressions of proliferation and apoptosisrelated proteins

2.2地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞氧化应激的影响 与Con组比较，LPS组H9C2细胞MDA含量及培养上清中LDH含量升高（P＜0.05），细胞中SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）。与LPS组比较，不同剂量地佐辛组H9C2细胞MDA含量及培养上清中LDH含量降低（P＜0.05），细胞中SOD和GSH-Px活性升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性（P＜0.05，表2）。

表2 地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞氧化应激的影响（±s，n=3）Tab.2 Effect of dezocine on oxidative stress of LPS-induced H9C2 cells（±s，n=3）

表2 地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞氧化应激的影响（±s，n=3）Tab.2 Effect of dezocine on oxidative stress of LPS-induced H9C2 cells（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with 4 µmol/L dezocine group，3）P＜0.05；compared with 8µmol/L dezocine group，4）P＜0.05.

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2.3地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞miR-204-3p表达的影响 与Con组比较，LPS组H9C2细胞miR-204-3p表达降低（P＜0.05）。与LPS组比较，不同剂量地佐辛组H9C2细胞miR-204-3p表达升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性（P＜0.05，表3）。

表3 地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞miR-204-3p表达的影响（±s，n=3）Tab.3 Effect of dezocine on expression of miR-204-3p in H9C2 induced by LPS（±s，n=3）

表3 地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞miR-204-3p表达的影响（±s，n=3）Tab.3 Effect of dezocine on expression of miR-204-3p in H9C2 induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with 4 µmol/L dezocine group，3）P＜0.05；compared with 8µmol/L dezocine group，4）P＜0.05.

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2.4干扰miR-204-3p表达逆转地佐辛对LPS处理的H9C2细胞增殖和凋亡的影响 与16 µmol/L地佐辛组或16 µmol/L地佐辛+anti-miR-NC组比较，16µmol/L地佐辛+anti-miR-204-3p组H9C2细胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05），细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达升高（P＜0.05），而16 µmol/L地佐辛组或16 µmol/L地佐辛+anti-miRNC组各指标差异无统计学意义（P＞0.05，图2、表4）。

图2 干扰miR-204-3p表达逆转地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞凋亡及增殖、凋亡相关蛋白表达的影响Fig.2 Interfering with miR-204-3p reversed effect of dezocine on LPS-induced H9C2 cells apoptosis and expressions of proliferation and apoptosis-related proteins

表4 干扰miR-204-3p表达逆转地佐辛对LPS处理的H9C2细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=3）Tab.4 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

表4 干扰miR-204-3p表达逆转地佐辛对LPS处理的H9C2细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=3）Tab.4 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with 16µmol/L dezocine group，1）P＜0.05；compared with 16µmol/L dezocine+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

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2.5干扰miR-204-3p表达逆转地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞氧化应激的影响 与16 µmol/L地佐辛 组 或16 µmol/L地 佐 辛+anti-miR-NC组 比 较，16 µmol/L地 佐 辛+anti-miR-204-3p组H9C2细 胞MDA含量及培养上清中LDH含量升高（P＜0.05），细胞SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05），而16 µmol/L地佐辛组或16 µmol/L地佐辛+anti-miR-NC组各指标差异均无统计学意义（P＞0.05，表5）。

表5 干扰miR-204-3p表达逆转地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞氧化应激的影响（±s，n=3）Tab.5 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on oxidative stress of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

表5 干扰miR-204-3p表达逆转地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞氧化应激的影响（±s，n=3）Tab.5 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on oxidative stress of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with 16µmol/L dezocine group，1）P＜0.05；compared with 16µmol/L dezocine+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

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3 讨论

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁主要成分，可引起细胞凋亡、炎症反应和氧化应激等，导致多器官功能损伤，是建立心肌细胞损伤模型的常用诱导剂［6］。本研究显示，LPS可抑制H9C2细胞增殖，且促进其氧化应激和凋亡，与XU等［7］结果一致，说明LPS诱导的心肌细胞损伤模型建立成功。

地佐辛作为一种阿片受体激动-拮抗剂，常用于手术麻醉［8］。研究显示，地佐辛可能通过抑制HCN通道开放增加抗氧化应激相关蛋白Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表达减少β淀粉样多肽诱发的原代大鼠皮质星形胶质细胞凋亡［9］。地佐辛可通过抑制Caspase-3表达和降低细胞氧化应激反应减轻大鼠脑缺血再灌注神经元损伤［10］。本研究显示，不同剂量地佐辛促进LPS诱导的H9C2细胞增殖，且抑制其凋亡。细胞增殖和凋亡受多种基因调控。CyclinD1是细胞周期调控蛋白，其表达升高可加速细胞周期进程，促进细胞增殖［11］。p21是细胞周期抑制因子，其表达增加则抑制细胞增殖［12］。Bax和Bcl-2参与调控细胞凋亡。Bax是促凋亡蛋白，其表达升高可加速细胞凋亡；而Bcl-2与Bax作用相反，其表达升高抑制细胞凋亡［13］。本研究显示，不同剂量地佐辛抑制了LPS诱导的H9C2细胞CyclinD1和Bax蛋白表达，促进p21和Bcl-2蛋白表达，进一步说明地佐辛可促进LPS诱导的H9C2细胞增殖，且抑制其凋亡。

氧化应激是心肌损伤的重要机制之一［14］。正常生理条件下，机体组织处于氧化和抗氧化动态平衡。病理条件下，机体组织自由基生成速率超过清除速率，产生氧化应激损伤。LDH是一种存在于细胞质的糖酵解酶。细胞受损时，细胞膜通透性增加，LDH被立即释放至细胞外，培养基中LDH活性高低可反映细胞受损程度［15］。MDA作为脂质过氧化产物之一，可反映机体组织氧化应激水平［16］。SOD和GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶，可清除自由基，减轻自由基对机体组织的损伤［17］。本研究显示，不同剂量地佐辛降低了LPS诱导的H9C2细胞培养上清中LDH及细胞MDA水平，且提高了细胞SOD和GSH-Px活性，表明地佐辛减轻了LPS诱导的H9C2细胞氧化应激损伤。

作为一种miRNA，miR-204-3p参与多种疾病发展进程。目前对miR-204-3p的研究多集中于肿瘤。研究显示，miR-204-3p在结肠癌、乳头状甲状腺癌、肾细胞癌等肿瘤中表达下调，发挥抑癌基因作用［18-20］；而miR-204-3p在口腔鳞状细胞癌和骨肉瘤等肿瘤中表达上调，促进肿瘤发展［21-22］。此外，miR-204-3p还参与非肿瘤发生发展。如HAN等［23］研究显示，miR-204-3p可靶向下调Bdkrb2表达抑制高糖诱导的足细胞凋亡，改善足细胞功能，为糖尿病肾病治疗提供了潜在靶点。本研究显示，LPS抑制H9C2细胞miR-204-3p表达，而地佐辛则促进LPS诱导的H9C2细胞miR-204-3p表达，且下调miR-204-3p表达逆转了地佐辛对LPS诱导的H9C2细胞增殖的促进作用及凋亡和氧化应激的抑制作用，提示地佐辛通过上调miR-204-3p表达促进LPS诱导的H9C2细胞增殖，且抑制其凋亡和氧化应激。

综上，地佐辛可抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激，减轻心肌细胞损伤，其作用机制可能与上调细胞miR-204-3p表达有关。