甘草己烷-乙醇提取物通过miR-151a-5p/GABARAPL1轴调控前列腺癌细胞增殖、凋亡①

孟庆荣 周振鹏 张 敏 王世平 孙秀斌 徐光玉

（山东第一医科大学附属济南人民医院泌尿外科，济南 271199）

前列腺癌是男性常见恶性肿瘤，研究表明多种 中药提取成分具有抑制前列腺癌细胞生长的作用，开发有效抑制前列腺癌细胞生长的中药对其治疗具有重要意义［1-2］。甘草是临床常用中药材，其提取物活性成分具有抗癌作用。研究报道，甘草己烷-乙醇提取物（hexane-ethanol extract of glycyrrhiza uralensis，HEGU）可抑制前列腺癌细胞迁移及乳腺癌细胞肺转移［3-4］。甘草提取物还可诱导宫颈癌细胞凋亡［5］。但HEGU对前列腺癌增殖、凋亡的影响及机制尚不清楚。研究发现，miRNA可影响前列腺癌恶性生物学行为［6］。前列腺癌组织中miR-151a-5p表达上调［7］。抑制miR-151a-5p表达可抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移，促进凋亡［8］。研究报道，GABA A型受体相关蛋白样1（GABA type A receptor associated protein like 1，GABARAPL1）在前列腺癌组织中下调，过表达GABARAPL1可降低细胞侵袭性［9］。本研究通过在线软件预测发现，miR-151a-5p与GABARAPL1存在结合位点，但miR-151a-5p是否靶向调控GABARAPL1尚未可知。因此，本研究旨在探究HEGU是否通过miR-151a-5p/GABARAPL1影响前列腺癌增殖、凋亡。

1 材料与方法

1.1材料 甘草购自山东天一饮片厂，产地内蒙古，经山环介导等温核酸扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法鉴定为豆科植物甘草（glycyrrhiza uralensis fisch）的干燥根；人前列腺癌细胞PC-3（货号：YS1994C，上海雅吉生物科技有限公司）；RPMI1640培养基（货号：GNM-31800，上海经科化学科技有限公司）；MTT试剂盒（货号：M1020，江西江蓝纯生物试剂有限公司）；凋亡检测试剂盒（货号：KA3805，艾美捷科技有限公司）；蛋白提取试剂盒（货号：CD-13559-ML，武汉纯度生物科技有限公司）；超敏ECL化学发光液（货号：XYM2301，上海信裕生物科技有限公司）；CyclinD1抗体（货号：PL0502539，加拿大PLLABS公司）；p21抗体（货号：252156）、Bcl-2抗体（货号：253037）、Bax抗体（货号：251834，美国Abbiotec公司）；GAPDH抗体（货号：AF7021，美国Affinity公司）；IgG-HRP二抗（货号：ASE134，上海吉至生化科技有限公司）；Trizol试剂（货号：GMS12279，上海杰美基因医药科技有限公司）；SYBR Premix ExTaq试剂盒（货号：DRR041A，北京智杰方远科技有限公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：KGAF040，江苏凯基生物技术股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1HEGU制备 参考文献［3］提取甘草：取100 g甘草干燥根，粉碎，室温下用己烷-乙醇（9∶1）溶液浸泡24 h，过滤除渣，萃取2次，过滤并合并2次提取液，减压浓缩滤液，即得到HEGU。

1.2.2细胞处理与分组 采用RPMI1640培养基常规培养PC-3细胞，取对数生长期细胞，分别用2、4、8µg/ml HEGU处理作为不同剂量HEGU组；不做处理的细胞作为NC组；将anti-con、anti-miR-151a-5p、miR-con、miR-151a-5p转染至PC-3细胞，作为anticon组、anti-miR-151a-5p组、miR-con组、miR-151a-5p组；将miR-con、miR-151a-5p转 染 至PC-3细 胞 后用8 µg/ml HEGU处 理，作 为HEGU+miR-con组、HEGU+miR-151a-5p组。

1.2.3MTT检测细胞增殖 采用2、4、8 µg/ml HEGU处理PC-3细胞24 h，更换新鲜培养基继续培养24 h、48 h、72 h，然后按照20µl/孔加入MTT溶液（5 mg/ml），孵育4 h，加入150 µl DMSO振荡反应10 min使沉淀溶解，酶标仪检测450 nm处吸光度（A450）。8µg/ml HEGU作用前列腺癌细胞0 h、6 h、12 h、24 h后，再培养24 h、48 h、72 h后按上述方法检测细胞活性。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集1.2.2中各组培养24 h细胞，预冷PBS漂洗2次，与500µl结合缓冲液混匀，加入10 µl AnnexinⅤ-FITC和5 µl PI混匀，避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。8 µg/ml HEGU作用前列腺癌细胞0 h、6 h、12 h、24 h后，分别再培养24 h后按上述方法检测细胞凋亡率。

1.2.5Western blot检测蛋白表达 提取各组培养24 h细胞总蛋白，蛋白定量后煮沸变性，进行SDSPAGE，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，加入ECL液显影，Quantity One分析蛋白条带灰度值，蛋白相对表达=目的条带相对表达/内参GAPDH条带相对表达。

1.2.6RT-qPCR检 测miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表达 提取各组培养24 h细胞总RNA，合成cDNA，按照试剂盒说明操作，PCR反应体系：2µl反转录产物、10 µl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 µl、7 µl无菌水；循环条件为95℃2 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40个循环；熔解曲线：95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。2-ΔΔCt计算相对表达。miR-151a-5p和GABARAPL1分 别 以U6和GAPDH为内参，miR-151a-5p正向引物：5'-GCGGCGGTCGAGGAGCTCACAG-3'，反向引物：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GABARAPL1正向引物：5'-ATCCGGAAGAGAATCCACCT-3'，反向引物：5'-GCTAGAGGATGCCAGACTGC-3'；GAPDH正向引物：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，反向引物：5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'。

1.2.7双荧光素酶报告实验检测miR-151a-5p和GABARAPL1的靶向关系 构建GABARAPL1野生型和突变型双荧光素酶载体WT-GABARAPL1和MUT-GABARAPL1，分别与miR-NC和miR-151a-5p共转染至PC-3细胞，按说明书检测荧光素酶活性。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用±s表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜

0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同剂量HEGU对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响 与NC组比较，不同剂量HEGU作用后，前列腺癌细胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达降低，p21、Bax表达升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05，表1、图1）。8µg/ml HEGU作用前列腺癌细胞后，与0 h相比，作用6 h、12 h、24 h后前列腺癌细胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达降低，p21、Bax表达升高，且呈时间依赖性（P＜0.05，表2、图2）。

图2 8 μg/ml HEGU不同作用时间对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响Fig.2 Effects of 8 μg/ml HEGU on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells at different times

表1 不同剂量HEGU对前列腺癌细胞增殖、凋亡、相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.1 Effects of different doses of HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表1 不同剂量HEGU对前列腺癌细胞增殖、凋亡、相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.1 Effects of different doses of HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05；compared with 2µg/ml group，2）P＜0.05；compared with 4µg/ml group，3）P＜0.05.

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表2 8 μg/ml HEGU不同作用时间对前列腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.2 Effects of 8 μg/ml HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表2 8 μg/ml HEGU不同作用时间对前列腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.2 Effects of 8 μg/ml HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with 0 h group，1）P＜0.05；compared with 6 h group，2）P＜0.05；compared with 12 h group，3）P＜0.05.

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图1 不同剂量HEGU对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响Fig.1 Effect of different doses of HEGU on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells

2.2不同剂量HEGU作用于前列腺癌细胞后对miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表 达的影 响与NC组比较，不同剂量HEGU作用后，前列腺癌细胞miR-151a-5p表达降低，GABARAPL1 mRNA表达升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05，表3）。

表3 不同剂量HEGU作用于前列腺癌细胞后对miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表达的影响（±s，n=5）Tab.3 Effects of different doses of HEGU on expressions of miR-151a-5p and GABARAPL1 mRNA in prostate cancer cells（±s，n=5）

表3 不同剂量HEGU作用于前列腺癌细胞后对miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表达的影响（±s，n=5）Tab.3 Effects of different doses of HEGU on expressions of miR-151a-5p and GABARAPL1 mRNA in prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05；compared with 2 µg/ml group，2）P＜0.05；compared with 4µg/ml group，3）P＜0.05.

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2.3anti-miR-151a-5p转染对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响 与anti-con组比较，anti-miR-151a-5p组miR-151a-5p表达、细胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达降低，p21、Bax表达升高（P＜0.05，表4、图3）。

表4 anti-miR-151a-5p转染对前列腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.4 Effect of anti-miR-151a-5p transfection on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表4 anti-miR-151a-5p转染对前列腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.4 Effect of anti-miR-151a-5p transfection on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with anti-con group，1）P＜0.05.

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图3 anti-miR-151a-5p对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响Fig.3 Effect of anti-miR-151a-5p on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells

2.4miR-151a-5p与GABARAPL1直接相互作用miR-151a-5p和GABARAPL1存在互补核苷酸序列（图4）。miR-151a-5p与WT-GABARAPL1共转染的细胞荧光素酶活性低于miR-con与WT-GABARAPL1共转染的细胞（P＜0.05）；而WT-GABARAPL1与miR-151a-5p或miR-con共转染的细胞荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05，表5）。

表5 双荧光素酶报告实验（±s，n=5）Tab.5 Double luciferase report experiment（±s，n=5）

表5 双荧光素酶报告实验（±s，n=5）Tab.5 Double luciferase report experiment（±s，n=5）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05.

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图4 miR-151a-5p和GABARAPL1存在互补核苷酸序列Fig.4 miR-151a-5p and GABARAPL1 have complementary nucleotide sequences

2.5miR-151a-5p调控前列腺癌细胞系中GABARAPL1表达 与miR-con组比较，miR-151a-5p组miR-151a-5p表达升高，GABARAPL mRNA表达降低（P＜0.05）；与anti-miR-con组比较，anti-miR-151a-5p组miR-151a-5p表达降低，GABARAPL mRNA表达升高（P＜0.05，表6）。

表6 转染miR-151a-5p mimic和anti-miR-151a-5p对前列腺癌细胞GABARAPL1 mRNA表达的影响（±s，n=5）Tab.6 Effect of transfection of miR-151a-5p mimic and anti-miR-151a-5p on GABARAPL1 mRNA expression in prostate cancer cells（±s，n=5）

表6 转染miR-151a-5p mimic和anti-miR-151a-5p对前列腺癌细胞GABARAPL1 mRNA表达的影响（±s，n=5）Tab.6 Effect of transfection of miR-151a-5p mimic and anti-miR-151a-5p on GABARAPL1 mRNA expression in prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05；compared with antimiR-con group，2）P＜0.05.

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2.6过表达miR-151a-5p逆转HEGU（8 µg/ml）对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响 与miR-con组比较，miR-151a-5p组GABARAPL1 mRNA表达降低，miR-151a-5p表达升高，细胞活性升高，凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表达升高，p21、Bax表达降低（P＜0.05）；与HEGU+miR-con组比较，HEGU+miR-151a-5p组GABARAPL1 mRNA表达降低，miR-151a-5p表达升高，细胞活性升高，凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表达升高，p21、Bax表达降低（P＜0.05，表7、图5）。

表7 过表达miR-151a-5p逆转HEGU（8 μg/ml）对前列腺癌细胞增殖、凋亡、相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.7 Overexpression of miR-151a-5p reverses effects of HEGU（8 μg/ml）on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表7 过表达miR-151a-5p逆转HEGU（8 μg/ml）对前列腺癌细胞增殖、凋亡、相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.7 Overexpression of miR-151a-5p reverses effects of HEGU（8 μg/ml）on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05；compared with HEGU+miR-con group，2）P＜0.05.

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图5 过表达miR-151a-5p逆转HEGU（8 μg/ml）对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响Fig.5 Overexpression of miR-151a-5p reverses effect of HEGU（8 μg/ml）on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells

3 讨论

研究显示，中医药辅助治疗前列腺癌不仅能提高临床疗效，还能减轻不良反应，提高患者生活质量［10］。因此，开发抗前列腺癌的中药有助于前列腺癌治疗。研究报道，甘草提取物Gc34可抑制肝癌细胞侵袭、增殖，抑制胃癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡，说明甘草提取物对不同肿瘤均有抑制作用［11-12］。为研究甘草提取物是否对前列腺癌细胞具有抑制作用，本研究采用2、4、8µg/ml HEGU处理前列腺癌细胞PC-3，结果显示，细胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达降低，p21、Bax表达升高，且呈剂量依赖性，表明HEGU可剂量依赖性抑制前列腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

研究报道，miR-151a-5p在大肠癌中显著过表达，可作为大肠癌诊断的潜在生物标志物［13］。下调miR-151a-5p表达能抑制A549细胞增殖、迁移及侵袭［14］。已有研究报道，miR-151a-5p在前列腺癌组织中表达上调，但miR-151a-5p对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响尚不清楚。为研究miR-151a-5p对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响，本研究将miR-151a-5p表达抑制载体转染至PC-3细胞，结果显示，细胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达降低，p21、Bax表达升高，表明抑制miR-151a-5p表达可抑制前列腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，且HEGU处理的前列腺癌细胞PC-3中miR-151a-5p表达降低，提示HEGU可能调控miR-151a-5p表达。为阐明miR-151a-5p是否影响HEGU对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响，本研究过表达miR-151a-5p后采用HEGU处理前列腺癌细胞PC-3，结果显示，过表达miR-151a-5p逆转了HEGU对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响。提示HEGU可能通过调控miR-151a-5p影响前列腺癌细胞增殖、凋亡。

研究报道，GABARAPL1低表达与肝细胞癌患者不良预后相关［15］。抑制GABARAPL1表达可抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移，并诱导细胞凋亡［16］。miR-143通过靶向GABARAPL1抑制胃癌细胞自噬提高槲皮素功效［17］。白藜芦醇可通过下调GABARAPL1表达抑制乳腺癌BT474细胞增殖并诱导其凋亡［18］。本研究通过在线软件预测发现，miR-151a-5p与GABARAPL1存在结合位点，双荧光素酶实验证实了miR-151a-5p可靶向调控GABARAPL1表达；此外，分别检测了过表达miR-151a-5p和抑制miR-151a-5p表达后GABARAPL1表达，发现miR-151a-5p可负调控GABARAPL1表达。本研究进一步检测了HEGU处理前列腺癌细胞PC-3后GABARAPL1表达，发现GABARAPL1呈高表达。提示HEGU可调控前列腺癌细胞GABARAPL1表达。

综上，HEGU可能通过调控miR-151a-5p/GABARAPL1轴抑制前列腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。但本研究仅在体外细胞中进行相关实验，其是否在体内起作用有待进一步研究，今后将进一步通过体内实验进行验证。本研究为HEGU临床用于前列腺癌防治提供了理论依据。