断血流提取物的体内外止血性能评价

白少云，李梦婷，曹子琴，单 爽，吴佳宝，何 宁,,,(安徽中医药大学药学院药剂系，合肥 00；药物制剂技术与应用安徽省重点实验室；安徽省中医药科学院药物制剂研究所；现代药物制剂安徽省工程技术研究中心；通讯作者,E-mail:hening86@6.com)

在中国南宋时期的《履巉岩本草》中，收载了一种特征与断血流原植物非常相似的草药“草血竭”，在民间应用广泛，且具有止血功效[1]。断血流是安徽省“十大皖药”之一，早在1977年就开始收载于《中国药典》，主要以风轮菜、灯笼草为中药断血流的来源，具有收敛止血之功效，可用于尿血、崩漏、鼻衄、创伤出血、牙龈出血，可口服及外用适量敷于伤口[2]。断血流主要以其茎叶干品入药，皂苷类及黄酮类是其主要化学成分，其中断血流皂苷A是主要止血成分[3]。在临床上断血流良好的止血疗效得到了验证且应用广泛，并且也有很多文献报道了其止血的药理研究[4-6]。文献记载将荫风轮粉末撒在清洁的出血伤面后，稍加压迫，用绷带等包扎可立即止血[7]。目前临床应用的断血流产品主要有断血流片、断血流胶囊、断血流颗粒、断血流口服液等，这些剂型大多是通过内服而发挥止血功效，而未见市售的断血流外用产品，导致这一现象的原因可能与断血流外用止血性能的评价和机制研究不充分有关。本研究主要通过在体和离体的方式对断血流的外用止血性能进行评价，探讨断血流提取物对皮肤创伤的止血作用，为研发断血流外伤止血产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

HH0-501超热恒温水浴(金坛市晶玻实验仪器厂)；TG16A-WS台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；BUCHI旋转蒸发仪(步琦实验室设备贸易(上海)有限公司)；电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)；显微镜(上海明兹精密仪器有限公司)。断血流药材(亳州药材市场，经安徽中医药大学金传山教授鉴定为唇形科风轮菜的全草)；云南白药粉末(云南白药集团股份有限公司)；无水乙醇(江苏强盛功能化学股份有限公司)；柠檬酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；生理盐水(安徽丰原药业股份有限公司淮海药厂)。

1.2 实验动物

健康雄性成年SD大鼠，体质量190～210 g(安徽中医药大学实验动物中心)，动物伦理号：AHUCM-rats-2021097；健康雄性新西兰大白兔，体质量2.0～2.5 kg(安徽中医药大学实验动物中心)，动物伦理号：AHUCM-rabbits-2021132。

1.3 实验方法

1.3.1 断血流提取物的制备 称取一定量的断血流药材粗粉，加入75%的乙醇，用量是药材的12倍，加热回流提取两次，每次2 h。将两次提取液离心、过滤除去药渣，将药液浓缩成浸膏，即得断血流浸膏[8]，浸膏干燥后粉碎即得断血流提取物粉末。

1.3.2 实验分组情况及处理 ①血小板黏附率实验和血浆复钙时间实验的分组情况及处理：实验分为3组，每组平行3次。生理盐水组：0.9%氯化钠溶液；断血流提取物组：将断血流提取物粉末配制成3.3 mg/ml的溶液，3 000 r/min离心取上清液，备用；云南白药组：将云南白药粉末配制成3.3 mg/ml的溶液，3 000 r/min离心取上清液，备用。②大鼠股静脉止血实验和兔耳动脉止血实验的分组情况及处理：9只SD大鼠随机分成3组，每组3只，分别为空白对照组、断血流浸膏组、云南白药粉末组，每只大鼠建立大鼠股静脉出血模型。9只新西兰兔随机分成3组，每组3只，分别为空白对照组、断血流浸膏组、云南白药粉末组，每只新西兰兔建立兔耳动脉出血模型。

1.3.3 断血流提取物的血小板黏附效果评价 新西兰兔心脏取血，加入3.8%柠檬酸钠(9 ∶1)，得到抗凝兔血，以1 000 r/min的转速离心10 min，吸取上清液，即得血小板血浆。分别在装有0.1 ml生理盐水、3.3 mg/ml云南白药、3.3 mg/ml断血流提取物的离心管中，加入0.1 ml血小板溶液，然后在每个离心管中放入一个直径为3.0 mm的小玻璃球，微型涡旋混合仪振荡10 min。用移液枪吸取适量滴于血球计数板上，在显微镜下计数。每组测定3次取平均值。按公式(1)计算血小板的黏附率。

(1)

式中：PAdR为血小板黏附率(%)，N0为黏附前血小板数，Nf为黏附后血小板数。

1.3.4 断血流提取物的血浆复钙时间效果评价 新西兰兔心脏取血，加入3.8%柠檬酸钠(9 ∶1)，得到抗凝兔血，以1 000 r/min的转速离心10 min，吸取上清液，即得血浆。准备37 ℃预热的离心管9只，分为3组，每组3只。分别向离心管中加入0.1 ml生理盐水、0.1 ml 3.3 mg/ml云南白药、0.1 ml 3.3 mg/ml断血流提取物，再加入0.1 ml血浆，0.1 ml质量分数为0.277 5%的CaCl2溶液，混匀后继续放置在37 ℃恒温水浴中，开始计时。30 s后，每10 s缓慢倾斜离心管，直至纤维蛋白形成、液面不动所需的时间即为血浆复钙时间。

1.3.5 断血流提取物的大鼠股静脉止血评价 健康雄性大鼠9只，体质量190～210 g，随机分为3组，分别为空白对照组、断血流浸膏组、云南白药粉末组。大鼠提前禁食，配制0.3%戊巴比妥钠备用，采用腹腔注射麻醉大鼠(1 ml/100 g)后，将大鼠仰位固定于实验台上，左侧腹部和大腿根部之间(即腹股沟)去毛，面积6 cm×5 cm左右。用碘伏对其消毒后，解剖大鼠大腿根部，并暴露股静脉，用注射器针头刺穿股静脉，使血液涌出，建立大鼠股静脉出血模型[9]。每组分别涂覆0.1 g断血流浸膏、0.1 g云南白药粉末，空白组伤口不用药物，再用无菌纱布覆盖，压上质量为50 g的砝码，开始计时。30 s后翻开纱布观察创面的出血情况，之后每隔10 s翻开纱布观察创面1次，记录血液不再渗出的时间，即为止血时间。将各组纱布分别称重，记录出血量。

1.3.6 断血流提取物的兔耳动脉止血评价 将9只健康新西兰兔随机分成3组，每组3只，分别为空白对照组、断血流浸膏组、云南白药粉末组。用30%乌拉坦耳缘静脉注射麻醉(5 ml/kg)后，采用左侧卧位的方式固定在实验台上面。对左耳背面皮肤进行脱毛处理，暴露血管，使用碘伏消毒，之后用手术刀横向割断耳动脉，血液流出，建立兔耳动脉出血模型[10]。皮肤出血模型建立成功后，每组分别立即涂覆0.1 g断血流浸膏和0.1 g云南白药粉末，空白组伤口不用药物，用无菌纱布覆盖，压上质量为20 g的砝码，开始计时。30 s后察看伤口的出血情况，之后每隔10 s翻开纱布察看创面1次，记录血液不再渗出时间即出血时间。将各组纱布分别称重，记录出血量。

2 结果

2.1 血小板黏附效果评价

血小板黏附实验结果显示，与生理盐水组相比较，云南白药组和断血流提取物组血小板黏附率显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)；而断血流提取物组与云南白药组间比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。表明云南白药和断血流提取物可以促进血小板黏附，从而促进凝血。

表1 断血流提取物对血小板黏附率的影响Table 1 Effect of the extract of Chinese Clinopodium herb on platelet adhesion

2.2 血浆复钙时间效果评价

血浆复钙时间的测定结果显示，与生理盐水组相比较，云南白药组和断血流提取物组血浆复钙时间明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；而断血流提取物组与云南白药组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2 断血流提取物对血浆复钙时间的影响Table 2 Effect of the extract of Chinese Clinopodium herb on plasma calcium rehydration

2.3 大鼠股静脉止血评价

在断血流提取物对大鼠股静脉损伤出血模型止血时间的影响方面，断血流浸膏组、云南白药粉末组与空白组相比较，出血量明显减少、止血时间明显缩短(P<0.05)；而断血流浸膏组与云南白药粉末组相比较，出血量和止血时间相当(P>0.05，见表3)。表明断血流浸膏可以显著缩短止血时间、减少出血量。

表3 断血流提取物对大鼠股静脉出血模型止血时间及出血量的影响Table 3 Effect of extract from Chinese Clinopodium herb on hemostasis time and bleeding volume of rats with femoral vein bleeding

2.4 兔耳动脉止血评价

断血流提取物对新西兰兔耳动脉出血的止血效果显示，断血流浸膏组、云南白药粉末组与空白对照组相比较，止血时间明显缩短，并且差异有统计学意义(P<0.05)；而断血流浸膏组与云南白药粉末组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

表4 断血流提取物对兔耳动脉出血模型止血时间及出血量的影响Table 4 Effect of extract of Chinese Clinopodium herb on hemostasis time and bleeding volume in rabbit ear artery bleeding

3 讨论

血小板是血液有效成分的一种，主要功能是止血和促凝血。血小板黏附率高表明止血效果好。血浆复钙时间(RT)是判断测定内源凝血系统缺陷的一种实验检查，血浆复钙时间缩短表明具有良好的止血效果。因此本实验选用血小板黏附率和血浆复钙时间两种离体指标[11]评价体外止血效果。结果表明断血流提取物能够明显促进血小板黏附、缩短血浆复钙时间，从而起到凝血止血效果。采用大鼠股静脉出血和兔耳动脉出血实验测定止血时间和出血量，考察断血流提取物的体内止血效果，结果表明断血流提取物可以缩短出血时间，减少出血量，具有优异的止血性能。

本实验在SD大鼠股静脉出血模型的造模过程中，直接剪断股静脉出血量过于凶猛，止血困难，故最后采用注射器针头刺破股静脉的方法来造股静脉出血模型。在新西兰兔耳动脉出血实验中，前期使用手术刀横断耳静脉来造模，但是出血量较少，各组所用材料均能迅速止血，而兔耳的背部分布着一根动脉，该动脉与成年人的手臂上的主动脉大小相当，因此，用它作为生物材料的止血性能测试具有很好的模型作用[12]。故最后采取手术刀横向割断兔耳中央动脉的方式来建立模型。而在选择阳性参照物时，鉴于云南白药是当前常用的止血药[13]，因此本实验最终将云南白药作为阳性对照组。为了与云南白药粉末形成对照，曾尝试将断血流提取物粉末敷在伤口上，结果发现掀开纱布观察伤口时会粘连伤口，造成二次出血，影响止血时间和出血量的测定，因此制备断血流浸膏作为实验组。

综上所述，断血流提取物具有优异的止血作用，可以促进血小板黏附，缩短血浆复钙时间，缩短出血时间，减少出血量，为断血流开发成外用止血制剂提供了有利的理论依据。