陈皮中黄酮的提取分离纯化方法*

谷雪贤

(中山火炬职业技术学院健康产业学院，广东 中山 528436)

陈皮分为陈皮和广陈皮，是我国传统中药材之一，其中广陈皮作为广东省江门市新会区的地理标志特色产物。陈皮中含有黄酮、生物碱、挥发油等活性成分。其中挥发油主要成分为柠檬烯，别名苎烯，属于单萜类化合物，化学式C10H16，是一种天然的功能单萜，因为其有独特的香味，在食品、化妆品中可作香精香料；黄酮类物质具有良好的抗氧化功效，是一种具有药用价值的天然绿色成分，对陈皮中黄酮类化合物提取及其活性研究一直是陈皮研究的热点，目前已从该属植物中分离和鉴定的黄酮类化合物多达六十多种，主要包括：橙皮苷、新橙皮甙、柑橘素、二氢川陈皮素及5-去甲二氢川陈皮素等。其中橙皮苷含量最高，被2015版药典定义为陈皮的指标性成分，要求其含量不得低于3.5%[1]。

近10年内众多学者通过各种实验方法在各种植物中提取黄酮类化合物，其中使用得最多的方法是超声波法，微波反应器辅助法，CO2超临界流体法，有机溶剂热回流法，静态浸泡法等；分离纯化方法主要有大孔树脂吸附法、层析法、制备高效液相色谱法等，定性定量分析方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色谱法及液相色谱——质谱联用技术等。

1 陈皮中黄酮混合液的提取方法

1.1 碱性水提取法

由于黄酮化合物分子结构中苯环上的羟基，使其具有亲水和酸度，所以能在弱碱水中溶解。常用氢氧化钠稀溶液浸泡提取植物中的黄酮类物质。焦镭等[2]验证：用pH值为8.5，液料比25∶1 mL/g，温度为90 ℃的条件下提取3 h可得山楂叶总黄酮的提取量为7.97 mg/g。

1.2 有机溶剂提取法

用石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇等有机溶剂提取陈皮中的黄酮是实验室中最常见的方法，其主要原因是黄酮苷元难溶或不溶于水，易溶于有机溶剂。但该方法采用的有机溶剂大多都对人体有害，并可造成环境污染，同时提取过程中因采用了加热工艺，可能破坏其有效成分。

钟桂云等研究了乙醇提取陈皮中黄酮含量的影响因素，结果表明主要的影响因素有乙醇和水的比例、料液比、温度、提取次数及提取时间，其中乙醇和水的比例对提取率的影响很大，乙醇浓度高能促进黄酮的提取。经实验确定提取黄酮的最佳工艺条件为： 乙醇和水的比例为4∶1 (体积比)、料液比1∶30、提取温度75 ℃、提取时间2.5 h，在此条件下提取率为0.75%[3]。吴昊等[4]利用响应面法对陈皮黄酮的提取工艺进行了优化，在料液比为1∶30(g/mL)，乙醇浓度为70%，提取温度为73.2 ℃，提取时间为2.25 h的最佳工艺条件下，黄酮得率实测值为2.02%。吴迪[5]通过单因素实验证明提取陈皮中的黄酮化合物最适溶剂是乙醇，其次是甲醇，提取率最低的是水溶液，并用乙醇热回流法提取了陈皮中的黄酮类化合物，确定了8倍量60%乙醇回流提取3次(时间分别为1.5 h、1.0 h、0.5 h)为最佳工艺条件，总黄酮提取率为0.1351 mg/g。逢显娟等[6]采用溶剂热法提取陈皮中的橙皮苷，其最佳提取工艺条件为，提取温度120 ℃，乙醇浓度60%，液料比70∶1 mL/g，提取时间45 min，橙皮苷得率为6.07%±0.03%。比传统的乙醇回流法提取时间缩短了近70%，橙皮苷得率约提高1倍。

宋玉鹏等以丙酮-石油醚-水(6∶5∶5)为溶剂体系，采用简单、高效的多溶剂萃取法，从陈皮三氯甲烷萃取部分粗提物中分离得到纯度高于98%的川陈皮素和橘皮素[7]。

1.3 纤维素酶预处理联合热回流提取法

陈皮中的黄酮等大部分有效成分都被包裹在其细胞壁内，为了获取为获取目标成分，必须破坏其细胞壁，植物细胞的细胞壁主要成分为纤维素，而纤维素酶能够有效地破坏纤维素的β-1，4糖苷键，从而破坏纤维素的结构，进而提高有效成分的提取收率[8]。

2017年张利等利用响应面法优化了纤维素酶提取陈皮中橙皮苷的工艺条件，结果显示最佳工艺条件为：加酶量=0.79%、pH=3.45、T=59.07 ℃、t=2.13 h，此条件下预测橙皮苷得率为4.15%。比传统乙醇工艺提取橙皮苷得率提高了11.32%[9]。

2022年刘谦鸿等[10]利用纤维素酶预处理联合热回流提取法对陈皮中橙皮苷进行提取，其提取工艺为：首先将陈皮粉碎过0.150 mm孔径筛、然后用纤维素酶进行预处理、随后加入乙醇进行热回流提取。确定了最佳工艺条件为：(1)纤维素酶预处理：pH 4.8、温度45 ℃、酶解时间1.5 h、酶∶陈皮粉的质量比1∶30，(2)热回流提取：温度85 ℃、乙醇体积分数70%、提取时间3 h、料液比1∶25(g/mL)。在此条件的处理下，橙皮苷提取率为5.99%。一定程度地提高橙皮苷提取率，降低了污染。

1.4 超声波辅助提取法

超声提取法也是用于陈皮中黄酮类成分提取的常用方法之一，这是因为超声具有空化、热、力学等效应。在空化过程中，微泡的爆炸将会产生巨大的压力，从而在一瞬间引起植物细胞壁的破裂，利用植物的内液释放，从而减少了细胞内液体的溶解。破坏陈皮的细胞膜，促进黄酮等成分的释放。

郑美玲等利用超声波法提取了陈皮中的黄酮，确定了最佳工艺条件为料液比1∶30，乙醇体积分数80%，提取时间 20 min。在此条件下，陈皮黄酮的提取率为1.467%[11]。韩鹏虎等用均匀设计优化了超声波辅助提取陈皮总黄酮的工艺，最终确定乙醇的体积分数为70%、料液比为1∶20(g/mL)、超声时间为30 min为其最佳工艺条，此条件下陈皮总黄酮提取率为0.55%[12]。苏学军等[13]利用表面活性剂协同超声提取了陈皮中的总黄酮，在最佳提取工艺下提取率可达6.83%，其中表面活性剂为质量分数为0.5%的Tween20、乙醇的浓度为60%、料液比为1∶50(g/mL)、温度为70 ℃。何露等[14]用超声波辅助溶剂提取法提取了陈皮黄酮类化合物，设计响应面法对其提取工艺进行了优化，当乙醇质量分数为60%，超声时间为36 min，料液比为1∶25(g/mL)，所得黄酮提取率为24.75 mg/g，并且黄酮提取液用乙酸乙酯萃取和AB-8树脂纯化后，其抗氧化能力在纯显著增强，抗氧化能力的顺序为：AB-8 树脂纯化>乙酸乙酯萃取>纯化前。

1.5 微波辅助提取法

赵珉等[15]对比了纯水、碱水和乙醇三种不同溶剂对微波提取法提取率的影响，最终确定了最佳的提取溶剂为乙醇，提取率为2.268%。黄智等[16]研究采用微波辅助提取陈皮中橙皮苷的最优工艺条件：料液比1∶50、微波时间40 s、微波功率为240 W，在该条件下橙皮苷的提取为8.12%±0.04%。王慧芳等[17]依据单因素实验建立BBD实验模型，用响应面优化了微波辅助乙醇法提取陈皮中总黄酮的工艺，实验结果表明当乙醇体积浓度为60%、微波功率为619 W、时间为3 min、提取温度为62 ℃、料液比 1∶21(g/mL)时的黄酮得率最高，为1.3468%±0.0142%。

1.6 超临界萃取法

超临界流体萃取利用超临界流体为萃取剂多选用CO2，将原料中的黄酮化合物提取出来。超临界CO2萃取法具有提取工艺简单、操作条件温和、提取效率高、无有机溶剂残留等优点，并且还有利于热不稳定成分存在，使其生物活性成分不易发生改变，因此适用于黄酮化合物的提取。罗欢等采用正交试验法优选了超临界CO2萃取陈皮中川陈皮素和橘皮素的工艺，确定了最佳的萃取工艺条件为：t=2 h，T=35 ℃，P=30 MPa，流速u=20 kg/h，萃取率达1.96%，川陈皮素和橘皮素总含量为45.23 mg/g[18]。

油田的概念同时具有空间和类型两方面的涵义。就三维空间而言，油气的聚集应位于一定的地区、特定的地质单元的特定层系。就类型而言分类的方法很多，如业内常把是否能以传统方式打井直接开采而分为常规和非常规，以生储油组合的地层特点分海相和陆相等领域。在我们讨论的问题中新区一般指没有或仅有少量油田的一个较大的地区/地质单元（例如西藏高原、南黄海），新领域是指没有或仅有少量油气发现的勘探新层系、新类型。在实际工作中新区、新领域二者可有一定程度的交叉重叠。

除上述的四种萃取方法外，黄酮类化合物提取的方法还有多种，但是每种方法都各有不同的优缺点，因此，在选取最佳的萃取工艺时，应综合考虑原料性质、成本、设备等方面的因素，最终选择最为合适的提取方法。在实际操作中，为了提高黄酮化合物的的得率，一般会采用多种提取方法相结合的方式。

2 陈皮中黄酮的分离纯化方法

2.1 柱色谱法

柱色谱法是一种具有样品处理量大、分离速度快、分离效率高成本低等优点的高效的物理分离方法[19-21]。杨洁等[22]从陈皮80%乙醇的提取物中利用硅胶、ODS柱层析色谱法和重结晶分离纯化得到了12个单体化合物，其中8个是PMFs(多氧甲基黄酮)，首次从陈皮中分离得到了 8-羟基-3，5，6，7，3′，4′-六甲氧基黄酮和5，4′-二羟基-3，6，7，8，3′-五甲氧基黄酮。Fu等[23]采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20与ODS柱层析法相结合的方式，从陈皮中分离得到了9中聚甲氧基黄酮成分。吕小健等[24]先用无水乙醇浸提、然后依次用正己烷和二氯甲烷萃取得到了陈皮粗提物，再以硅胶做吸附剂，乙酸乙酯-石油醚做洗脱剂，分离得到了高纯度的川陈皮素和橘皮素。

2.2 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法具有上样量大、分离效率高、产物纯度高、回收率高等优点。孙印石等[25]采用高速逆流色谱法，以 2∶4∶3∶3的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，从陈皮粗产物中一步分离制备得到了桔皮素、5-羟基-6，7，8，3′，4′-五甲氧基黄酮，纯度均达到97.0%以上。郑国栋等[26]利用高速逆流色谱法，以1∶0.8∶0.7∶0.8的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，从300 mg广陈皮乙酸乙酯粗提物中一次性制备分离得到了川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮和橘皮素，其纯度分别为96.25%、97.10%、99.22%。

2.3 大孔树脂吸附法

大孔树脂吸附法是利用特殊的吸附剂与陈皮中的黄酮所产生的范德华引力或氢键作用，实现对黄酮的吸附分离，然后再通过选择合适的溶剂将吸附在吸附剂上的黄酮物质洗脱下来，实现黄酮组分的富集。

刘韶等[27]筛选陈皮中多甲氧基黄酮类的大孔树脂纯化工艺，比较了D101型和DM130型大孔树脂对陈皮中多甲氧基类黄酮的吸附效果，结果表明D101型大孔树脂为较佳的吸附树脂，经过处理后川陈皮素和橘皮素的纯度分别提高了3.7倍和3.2倍。

王惠芳等[28]考察了HPD-100、HP-20、AB-8、X-5、NKA-Ⅱ五种大孔树脂对黄酮的静态吸附及其解吸作用并筛选了最佳吸附脱附条件，实验结果表明HP-20大孔树脂最适合分离纯化陈皮中的黄酮，在最佳工艺条件为下黄酮回收率达64.95%。

3 陈皮提取物中化学成分定性与定量分析的方法

目前，陈皮中黄酮类化合物的定性定量分析方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用等。因为紫外分光光度法的专属性较差，所以应用并不广泛。HPLC法具有分析快速，分离高效，检测灵敏等特点，王健芬[29]利用HCLP法测定橙皮苷含量，平均回收率分别为100.90%和99.25%，RSD分别为0.16%和1.20%高效液相色谱法在黄酮类化合物含量测定方面的应用较多。

王文昌等[30]利用超高效液相色谱法快速测定了陈皮及其提取物中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷4种黄酮类化合物的含量，与常规方法不同的主要是其流动相的组成，该方法中使用的流动相为17∶83的乙腈-1%乙酸溶液，实验结果表明精密度和准确度均较好。

李颖诗[31]UPLC-Q-TOF-MS 技术，通过对得到的高分陈皮提取物的高分辨飞行时间质谱总离子流色谱图进行分析，最终鉴定出50个化学成分，其中主要成分为甲氧基黄酮及其同分异构体物质。

4 结 语

陈皮作为中国的传统中药材之一中含有丰富的黄酮的物质并且组成复杂，目前研究较多的仍是混合黄酮成分的提取，而对高效且适于工业化的分离纯化方法研究较少，而如果要对陈皮中黄酮物质的具体化学组分、结构研究及其活性进行深入研究仍需对其分离纯化方法、工艺以及定性定量分析方法等进一步研究优化。