血液中乙醇测定影响因素探讨

张栖沥

(玉溪明镜司法鉴定中心，云南 玉溪 653100)

血液中乙醇的测定，经历不断地发展和完善，目前常用于司法鉴定机构中的方法是顶空-气相色谱法。顶空-气相色谱法，是在气相色谱仪进样口前增加一个顶空进样装置(分为手动和自动)的一种色谱技术，也常被解释为将顶空进样器与气相色谱仪联用的仪器。其工作原理是以气体作为流动相，样品由微量注射器“注射”进入进样器，气化后被载气携带进入填充色谱柱或毛细管柱。由于样品中各组分在色谱中的流动相(气相)和固定相(固相)间分配或吸附系数的差异，各组分在两相间做反复多次分配，使各组分在柱中得到分离，在色谱柱后的检测器将各组分按顺序检测出来。顶空气相色谱分析相比普通色谱分析主要有以下优点：一、广泛使用，范围更广。既可分析液体样品中的挥发性组分，也能分析固体样品中的挥发性物质；既适用于单组分挥发性气样的分析，也能对组成复杂的挥发性组分混合物进行分离分析；既能用于常量顶空气样分析，又能检测低含量的挥发性组分。二、快速简便、进样准确。顶空气相色谱分析直接取液体样品(或固体样品)的挥发性气态样品送进气相色谱仪进行分离分析。在很多情况下，可以省去样品前处理操作，人为干扰因素少，故此法要比普通的色谱分析更为快速简便。另外，由于采用定量管进样，分析更准确。三、低检测限、重现性好。顶空气相色谱分析有时还可获得比普通气相色谱分析更低的检测限，这是因为避开了常规样品前处理过程中所带来的溶剂干扰、以及顶空样品的某些特殊性的缘故。其由于压力平衡自动进样，重现性更好。由于顶空-气相色谱仪分析具有独特的优越性，因此，在食品科学、环境科学、材料科学、生化科学分析领域中，得到了广泛的应用。我国公安部发布的行业标准GA/T 1073-2013《生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法》[1]和GA/T 842-2019《血液酒精含量的检验方法》[2]中对血液中乙醇的测定就是通过使用顶空-气相色谱法，以乙醇的保留时间或相对保留时间进行定性，采用内标法或外标法定量，从而完成对液中乙醇的定性定量测定。

1 血液中乙醇测定影响因素

1.1 色谱柱分析系统的影响

气化后的样品在色谱柱种中被分离，随载气进入检测器。因此。色谱柱是气相色谱仪的核心部件，合理地选择色谱柱是建立较佳的色谱分析方法的中心环节。

色谱柱一般分为：填充柱和毛细管柱两大类型。填充柱通常柱长1～3 m，内径3～6 mm，一般短柱用玻璃管，长柱用不锈钢管。毛细管柱是用玻璃或熔融石英拉制成毛细管的色谱柱。柱长20～50 m，内径0.1～0.5 mm。相对于填充柱来说，毛细管柱一般具有更高的分离效能，这是因为：(1)毛细管柱孔径小，内壁固定液膜极薄，中心是空的，故阻力很小，而且涡流扩散项不存在，谱带展宽变小。由于毛细管柱的阻力很小，其长度可为填充柱的几十倍，其总柱效比填充柱高得多。(2)毛细管柱的分析速度约为填充柱的数十倍。由于液膜极薄，分配比k很小，相比大，组分在固定相中的传质速度极快，因此有利于提高柱效和分析速度。(3)柱使用寿命长。当然，毛细管柱也有其局限性。因其内径小，柱容量小，且对进样技术的要求更高，所以载气流速的控制要求更为精确。进样量越小，意味着对检测器的灵敏度要求就更高。因此，在血液中乙醇检测的气相色谱系统中，常用的色谱柱为毛细管色谱柱，检测器为FID检测器(火焰离子化检测器)。在GA/T 1073-2013《生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法》和GA/T 842-2019《血液酒精含量的检验方法》气相色谱检测参考条件中，DB-ALC1和DB-ALC2就是血液中乙醇分析中常用的超高惰性色谱柱，在很长一段时间内都能保持良好的重现性与稳定性。

1.1.1 单柱与双柱的定性

采用顶空-气相色谱法(单柱单检测器)进行血液中乙醇含量检测时，当存在与乙醇(如卤代羟基烷类吸入用全身麻醉剂)具有相似色谱行为的化合物时，在某些特定的色谱条件下，此类化合物的保留时间会和乙醇的保留时间相近，进而导致色谱峰重合，最终会对检测的结果形成干扰，此时将无法对阳性结果进行准确有效的甄别[3]。当定性无法准确甄别判定时，就可能导致假阳性的定性，对当事人造成不利影响，进而让办案机关对鉴定机构的鉴定质量产生质疑。

通过改变色谱柱、柱温、载气流速等气相色谱检测条件，可在一定程度上排除此类干扰物对乙醇定性分析的影响。因此，使用区分效能充足的双色谱柱和双FID检测器系统进行血液中乙醇含量检测是定性判定的关键因素，双柱双检测器的气相色谱系统可以显著降低假阳性判定的发生率，从而最终达到保障检测机构公信力的目的。

1.1.2 双柱存在定量差异

在日常检测工作中，血液中乙醇的定量方法通常采用内标法(主要为内标工作曲线法)。即在一系列不同浓度对照品溶液中加入相同内标物，分别测定其峰面积，以对照品峰面积与内标物峰面积的比值对对照品溶液浓度作线性回归，求出线性回归方程或绘制工作曲线，最终测定检材的待测物的浓度。检测过程中若出现干扰物，尤其是干扰物与内标物保留时间相近，此时便会造成内标物与干扰物未良好分离，从而导致内标峰面积受到影响，最终造成双柱的定量结果有较大差异。2016 年，文迪等[4]在对两例血液乙醇含量检测中，均检出了丙酮成分，丙酮与叔丁醇的保留时间重合导致内标峰面积增加。2019年，许龙慧等[5]在对一例血液乙醇含量检测中，检出未知干扰物，干扰物与叔丁醇的保留时间重合导致内标峰面积增加。当内标峰面积增加，最终会使乙醇测定值降低，对乙醇定量结果产生干扰。因此，在检测过程中，还应该特别注意未知干扰物对检测体系的影响。双柱双检测器是提高气相色谱系统抗干扰能力有效方法(其中前文提到的DB-ALC2由于独特的极性，对于关键的乙醇/丙酮峰，比其它血液乙醇确证毛细管柱有更高的分离度)，通过双柱双检测器系统，可以及时发现内边峰面积的异常变化，除此之外，检测机构在日常工作中，需要经常关注容易产生假阳性的有关化合物和干扰物的相关文献报道，有条件的机构还可以通过气相色谱质谱联用法对未知干扰物进行定性的确证分析。

1.2 血液样本的采集和保存条件的影响

1.2.1 血液采集前处理

在采集血液前的消毒过程中，如果抽血人员使用了含有乙醇类的消毒剂时，并且在消毒剂未挥发前便进行采血，可能导致提取的血液受到外来乙醇污染，并最终引发血液中乙醇的定量结果异常升高的问题[6]。因此采集血液样本时，皮肤消毒剂宜使用不含醇类的聚维酮碘、0.1%苯扎氯铵溶液、0.1%苯扎溴铵溶液、1.0%醋酸氯己定溶液、双氧水(20%)及不含乙醇的碘伏溶液，不应使用含醇类或其他挥发性有机物的消毒剂[7]，彻底避免血液的假性升高问题。

1.2.2 血液采集部位

真空静脉采血由于在全封闭的系统下进行，而且真空采血管盖帽密封性较好、胶塞中间有凹槽，这样从根本上减少了血液受到接触污染的机会，降低了血液样本污染、溶血、凝血的发生，因此，活体的血液采集一般都选择体表浅静脉的真空采血。但是在有人员伤亡的交通事故或者因酗酒导致乙醇中毒的死亡案件中，由于人体在死亡后，身体代谢机能停止，胃内的乙醇会弥散到邻近的器官，当弥散发生后，此时各器官组织内的乙醇含量会存在明显的差别。采集不同器官组织部位的血液，最终的乙醇定量结果也会不同。因此，在抽取尸体血液时，为了防止乙醇弥散所带来的影响，此时需要首选股静脉或锁骨下静脉血液采集；溺死尸体因液体进入肺内，心血被稀释，亦应采周围血；对于损伤严重或残缺的尸体，在无法提取到股静脉或锁骨下静脉血液时，则可选择心脏包腔血液[7]。

1.2.3 血液的保存

(1)血液储存容器

谢春等[8]研究发现，不同储存容器对血液中乙醇浓度均有影响。普通采血管的乙醇浓度高于真空普通管，而真空普通管的乙醇浓度又高于真空抗凝管。造成乙醇浓度有差异的原因是：真空抗凝管能使血液保持在真空封闭的状态，避免了乙醇的挥发、阻止了抗凝管内外物质的交换，并且因为抗凝剂的添加，有效防止了血液发生凝固。使用普通采血管、甚至促凝剂管采集的血样，由于采血管内未添加抗凝剂，血浆中的纤维蛋白原转变为不溶的纤维蛋白，血细胞聚集从而形成血凝块。当血液发生凝固后，此时采血管内的固相便会增加、而相对应的液相便会减少，最终导致血样中乙醇含量检测结果比抗凝管的结果高，因此真空抗凝管是血液中乙醇测定中样本储存的最佳容器。而在常见的真空抗凝管中，当抗凝剂的种类不同时，因为抗凝管自身所含的液体体积会有差异，所以采集血样后，不同种类抗凝剂对血液的稀释作用也会有差异，最终导致血样中乙醇含量定量结果也会有差异。涂国章等[9]研究发现EDTA-K2采血管作为储存容器时，其血液乙醇含量检测结果的准确性最好。因此，道路交通执法人员为了确保血液乙醇检测结果的准确性，最好采用EDTA-K2采血管来储存涉嫌酒驾的的人员的血样，并按相关规定送检。

(2)采血管的保存条件

血样在保存过程中，会因温度和时间而发生不同程度的自溶、腐败、挥发、氧化等问题，不同温度及时间对保存血液的有效期和质量均有影响，随温度的升高，血液保存时效将会缩短，血液质量将因损伤加强而下降，同一时期内血液保存损伤作用随温度的降低而减轻[10]，所以血液乙醇含量检测必须控制好合适的血样保存温度以确保血液质量在有效的检测时间内不发生变化，从而保证检测结果的准确性。涂国章等[11]研究的4个温度保存条件中，14天内保存可在4～8 ℃冰箱冷藏，较长时间则在-20 ℃冰柜保存对血液乙醇含量检测影响较小。因此，执法机构在按照规定抽血后需要低温保存并及时送检，检测机构在受理委托后，需要及时鉴定，不能及时鉴定的也必须低温直立保存。

1.3 腐败尸体血

人体死亡后，在适当的温度、湿度和空气气流条件下，组织蛋白质会在人体内的微生物(主要是腐败细菌)的作用下发生腐败分解，从而发生尸体腐败。尸体腐败会伴随产生乙醇、正丙醇、正丁醇等多种产物，且随着时间延长，腐败程度会加重。尤其是超过一天的尸体，不可忽视死后组织腐败产生的乙醇量。针对死后腐败血液中乙醇含量测定，需要综合考虑死者生前的饮酒史以及是否患有糖尿病，避免血液腐败后的自生醇现象对乙醇含量测定结果分析产生干扰[12]。刘兆等[13]研究发现腐败尸体中生成的正丙醇和乙醇具有相关性，尸体在产生乙醇的同时，会平行地产生正丙醇，如果血中乙醇含量在正丙醇的20倍以内，可以认定是死后产生的乙醇；如超过此值，则系生前饮酒的标志。但是随着研究的不断深入，正丙醇已不能作为血液中乙醇系腐败产生的唯一依据，其作为腐败尸体中乙醇生成浓度的指标价值变得越来越有限。禹明筠等[14]研究表明，尸体血样腐败产生的乙醇不能导致 EtG (乙基葡萄糖醛酸苷)或 EtS (乙基硫酸酯)的产生。因此，血样中的 EtG 和 EtS 可作为判断尸体血样中乙醇生前入体和死后产生的依据，从而避免由于较高浓度的自生乙醇而导致乙醇认定的假阳性结果。除此之外，腐败尸体也可取玻璃体液测定乙醇含量(玻璃体液的乙醇含量在尸体腐败后一段时间内仍能保持稳定，血液与玻璃体液乙醇浓度的比例系数是0.98)。

1.4 检测机构日常质量控制

在实际的检测过程中，日常的质量控制是检测机构最基本同时也是最重要的一个环节。一、检测人员除了要具备最基本的相关专业知识和检测能力以外，还得不断学习新的专业技能，做到与时俱进，并且按时进行考核。二、检测机构按照规范要求配备好相应的检测设备后，在进行检测工作前，必须要对相应的设备进行校准检定，保证设备能够达到相对应的校准检定的规范要求达到的准确性和重复性，并制定期间核查计划和设备维护计划。三、检测机构需要定期查新血液中乙醇测定的检验规范和要求，通过实验室间比对或者能力验证考核，优化好设备的仪器参数条件。四、制备曲线时候所用到的标准品(不同浓度的乙醇标准样品)一定得选择有质检证书的国家级别的标准物质，且标准品在有效期内，这样才能保证曲线的有效性及准确性。五、检验检测的环境条件需要满足相关的标准要求，同时环境条件的记录需要真实和及时。检测结果会受到检测人员、分析仪器、检测方法和技术、检材质量、实验室环境等影响而产生一定的误差，产生检测结果的不确定度。血液中乙醇含量检测的不确定度主要来于检材重复性检测、乙醇标准曲线和气相色谱仪的误差[15]。因此检测机构的日常质量控制，是一项系统、复杂但是又基本、关键的工作，为了保证检测结果的准确性，检测机构应该重视日常的质量控制管理工作。

2 结 论

在司法鉴定中，血液中乙醇浓度测定的鉴定意见被视为醉驾案件审判的重要证据之一，其鉴定意见的合法性、真实性、准确性将会直接影响办案机关审判的公平公正，同时在酒驾醉驾案件处理、处罚及量刑上起着决定性作用。因此，检测机构在日常的血液中乙醇检测工作中，通过识别并规避血液中乙醇测定中的不利影响因素，可有效提高血液中乙醇测定结果的准确性，提高其司法鉴定意见的证据价值。