药物性肝损伤的生物标志物研究进展

李应懿 陈挥昂 谢青 赖荣陶

作者单位：200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科

药物性肝损伤(DILI)的临床和组织学表现可模拟多种其他肝病，缺乏客观、敏感性和特异性高的生物标志物，使得DILI的诊断始终基于排他性原则。而理想的DILI生物标志物应具备四个条件：有助于判断亚临床DILI，提高临床DILI诊断率；区分DILI的严重程度；鉴别适应性和进展性DILI；帮助判断DILI的预后。现就常用的肝脏生化学指标及近几年发现的DILI生物标志物做一介绍。

一、传统的肝脏生化指标及DILI评估模型

(一)评价 DILI 传统的肝脏生化指标 这些指标主要包括血清总胆红素 (TBil)、直接胆红素(DBil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ 谷氨酰转肽酶(GGT)等。

在这些生物标志物中，ALT主要存在于肝细胞的胞浆中，是肝功能损害最敏感的检测指标之一，但缺乏特异性。在人体中的ALT常以两种等量的亚型存在，即ALT1和ALT2。ALT2仅局限于肝外组织，特别是心脏和骨骼肌。最近的研究表明，评估ALT1和ALT2活性及各自对血浆中总ALT活性的百分比贡献够为区分肝损伤和肝外损伤提供有价值的证据[1]。然而目前临床实践中使用的标准ALT活性测定无法区分来自不同器官或亚型的血清ALT。AST主要存在于心肌细胞和肝脏细胞的线粒体中，临床AST血清水平升高提示心肌梗死、肝脏疾患，其中AST/ALT比值>1时，提示有肝实质细胞坏死；GGT在肾脏中分泌最多，胰和肝其次，在肝脏中主要分布于肝细胞浆和肝内胆管上皮，ALP通常作为检测肝脏或骨骼疾病的指标之一，分布在肝细胞的血窦侧和毛细胆管侧的微绒毛上，骨组织中存在的ALP与成骨细胞活性相关，而绝经后妇女的血清ALP水平也会升高。临床上GGT和AKP两者的血浆水平升高可能提示肝内外胆道梗阻或急性肝炎、肝硬化、慢性肝炎、酒精性肝病等其他病变；TBil是直接胆红素和间接胆红素的总和，正常范围3.4～17.1μmol/L，主要反映肝脏胆红素代谢水平及临床上衡量患者黄疸程度。

(二)传统生物标志物可用于评估DILI的严重程度 我国对于DILI的诊治主要参考2015年的《药物性肝损伤诊治指南》[2]，其中DILI的严重程度部分参考了国际上的DILI分级及我国肝衰竭指南，使用血清ALT、血清ALP、TBil以及INR、PTA等传统生物标志物将急性DILI的严重程度分为0～5级。

(三)eDISH 美国食品药品监督管理局(FDA)利用血浆ALT和TBil这两项传统的生物标志物，开发了一项基于海氏法则(Hy’s Law)，用于药物引起严重肝毒性的四象限评价图表，简称eDISH，用于FDA临床药物肝毒性评价[3]。海氏法则是基于Hyman Zimmerman博士临床实践修订后的产物，即ALT>3 ULN，血清ALP没有或微弱升高，TBil>2?ULN。eDISH根据Hy’s Law划分为四个象限，其坐标轴以ULN为刻度,以10为底的对数坐标，横纵轴分别为血浆ALT和TBil，象限划分直线分别对应3倍ULN的血清ALT以及两倍ULN的TBil。该图表右上象限、左上象限以及右下象限分别被命名为海氏定律象限(Hy’s Law Quadrant)、胆汁淤积象限(Cholestasis Quadrant)以及坦普尔推论象限(Temple’s Corollary Quadrant)，分别与可能导致严重肝损伤的风险、不符合海氏定律但存在潜在的药物性肝损伤的风险和造成胆汁淤积性肝损伤风险相关。鉴于这种方法的高效性，且在大规模筛查时具有优势，因此有望将其标准统一化，但该方法存在生物标志物种类少的局限性，且未来可能有更可靠的生物标志物的判断方法。

(四)DILIsym DILIsym模型是用于DILI研究的定量系统药理学(QSP)模型平台[4]，从药代动力学、发生机制(包括胆汁酸转运蛋白抑制、线粒体损伤、过氧化物应激)及在不同患者中发现差异性等多方面模拟和预测药物的肝细胞毒性，截至目前，该模型在23个测试药物中准确预测了21个药物的安全性(90%)。其系统局限性在于处理数据量时耗时长、所需数据较多，因此需要更多的子模型与药物以及更高效的计算能力进行持续优化。

(五)RO2 RO2(Rule of Two) 是2013年提出的一种通过每日药物口服摄入剂量和药物亲脂性判断患者药物摄入是否会引起肝毒性的一种判断方法[5]。项目通过对164种FDA批准口服药物的每日药物口服摄入剂量和药物亲脂性进行分析，发现口服用药同时符合亲脂性(辛醇-水分配系数，logP≥3)和每日药物口服剂量≥100 mg与DILI风险高度相关(OR=14.05；P<0.001)。但该模型对于DILI的严重程度缺乏预测性。在RO2的基础上，2016年该团队通过对FDA批准的354种口服药物进行分析，将药物活性代谢物(RM)加入RO2模型进一步提高DILI预测能力，其具体公式为基于每日剂量的0.608×log(每日剂量/mg) + 0.227×logP + 2.833×(有无RM形成，0或1)以及基于Cmax的0.511 × log (Cmax/10 nM) + 0.296×logP +2.809× (有无RM形成，0或1)。基于改良后的DILI评分模型，该团队通过对LiverTox数据库中的DILI案例分析认为≥7会造成严重临床后果(肝衰竭、死亡等)，<3不太可能造成严重临床后果。

然而，这些生物标志物中有许多并不具备肝毒性的特异性，或不能提供相关的损伤机制信息。特别是特异质性肝细胞损伤型 DILI 往往进展迅速，导致肝功能衰竭，因而对其相关生物标志物的探索也更为迫切，目前有潜在前景的DILI生物标志物包括蛋白组学、转录组学、药物基因组学和代谢组学等。

二、蛋白组学

目前研究的潜在DILI生物标志物多属于蛋白质，主要包括以下几种：

(一)谷氨酸脱氢酶(GLDH) GLDH是一种线粒体酶，主要存在于肝脏、肾脏和骨骼肌中。这种酶比ALT和AST更具组织特异性。健康个体的血清GLDH水平稳定，且不受年龄性别的影响。机体血清GLDH会在肝细胞坏死期间的线粒体膜损伤时升高，表明线粒体功能障碍。GLDH与各种形式的临床证明的肝损伤[包括对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)过量]患者的ALT升高密切相关，但其敏感性不足以预测ALT发生变化之前的APAP肝损伤[6]。

皮下肝素注射是一种常用于轻微肝损伤造模的手段。据报道接受皮下肝素注射的健康无症状志愿者会出现血清GLDH升高和ALT升高[7]，这表明GLDH和ALT有一定相关性。苹果酸脱氢酶(MDH)也有类似结果，MDH是柠檬酸循环中的一种组成酶，在组织损伤后释放到血清中。然而，MDH的组织特异性较低，血清水平会受到肝外组织损伤的影响。

(二)琥珀酸脱氢酶(SDH) SDH是一种细胞质酶，主要存在于肝脏和睾丸中，多年来一直被用作肝脏和睾丸疾病的诊断标志物。它是肝细胞损伤的敏感指标。与传统血清标志物相比，它在肝脏中的浓度变化更加明显。在接受皮下注射肝素的健康受试者中，观察到无症状时血清SDH水平升高，表明SDH能检测到轻微的肝损伤[7]。

据报道某些药物会抑制ALT的升高从而影响肝损伤的诊断。例如，使用低剂量D-青霉胺(10或15 mg/d)构建小鼠肉芽肿性肝炎，在诱导肝脏出现组织病理学改变之前可导致SDH和GLDH活性轻微增加，但无法观察到ALT浓度增加[8]。因此SDH相比ALT具有更强的抗干扰能力，可能是DILI中更具有特异性和敏感性的生物标志物。

(三)谷胱甘肽-S-转移酶(GST) GST是肝脏中丰富的细胞溶质酶，是肝脏特异性的肝毒性生物标志物。肝功能受损后，它会从肝细胞质释放到血浆中。因此，监测GST活性水平可能是诊断DILI的潜在物质。

谷胱甘肽-S-转移酶α(GSTa)是GST的同功酶，被证明是一种可行的生物标志物，因为其相比AST或ALT水平，在肝毒性期间的浓度增加更为显著。此外，GSTa在检测肝损伤和肝细胞空泡化方面也显示出更强的特异性，减少了基于肝外组织中ALT水平的假阳性结果。

(四)高迁移率组框蛋白1 (HMGB1) HMGB1是一种普遍存在的核蛋白，主要在 DNA结合和转录调控中发挥作用。它是调节DILI炎症反应的关键蛋白。HMGB1 可从坏死的肝细胞和激活的免疫细胞中释放。

在APAP毒性的小鼠模型中，总血清HMGB1与肝坏死水平的增加密切相关(R2= 0.75)，而血清乙酰化 HMGB1 与肝炎症细胞浸润相关[9]。同一研究指出，HMGB1不仅可以比ALT更早出现并量化DILI程度，由于血清半衰期较短，还比 ALT 更早恢复到基础水平。有临床研究发现，首次就诊时总血清 HMGB1可作为检测人类急性肝损伤的更敏感的生物标志物[6]。与ALT相比，APAP 过量患者(129例)首次入院时，总血清 HMGB1早期升高更快，HMGB1 (ROC0.97) 比ALT (ROC0.54)更能预测发生急性肝损伤的可能性。一项对APAP过量患者的ROC分析显示，血清中乙酰化HMGB1浓度越高，预后越差，乙酰化HMGB1比ALT更能预测患者的预后[10]。DILI发生期间，大多数高度乙酰化的 HMGB1 被认为由先天免疫细胞释放，虽然肝细胞也被证明在某些条件下分泌乙酰化的 HMGB1，但DILI期间的水平上升仍应当归因于DAMP对于先天免疫系统的激活。

然而，目前用于确定 HMGB1 浓度 (ELISA) 和 PTM (MS/MS) 的测定方法非常耗时，前者无法区分 HMGB1 的不同氧化还原和乙酰亚型，后者无法用于临床。此外，HMGB1 并非肝脏特异，因此虽然它作为预测 DILI 发展的生物标志物优于 ALT，但它应该与其他肝脏特异性标志物一起用于生物标志物组分析。

(五)中间丝角蛋白18(CK-18) CK-18是一种细胞骨架蛋白，是在肝脏中表达的主要中间丝家族成员。全长形式从坏死细胞中释放出来，而半胱天冬酶切割的片段(cc-CK18)是细胞凋亡过程中发生的结构变化的产物。可溶性 CK-18 片段可通过免疫测定在人血清中检测到。但在坏死期间，全长 CK-18 被动释放到循环中，只释放少量cc-CK18。血清中的CK-18 和 cc-CK18显示出作为预测肝衰竭和死亡的预后生物标志物的前景。一项动物实验证明，小鼠cc-CK18水平升高与肝细胞凋亡存在强烈关联[9]。一项针对APAP诱导的肝损伤(AILI)的研究报道，CK-18和 cc-CK18水平比ALT 水平更快出现显著升高[9]。“凋亡指数”(AI)是半胱天冬酶切割的角蛋白18 (cc-CK18) 与总角蛋白18 (包括全长CK-18 和半胱天冬酶切割的片段cc-CK18)的比率。临床研究显示，符合国王学院标准 (KCC)肝衰竭模型的患者 K18 和 ccK18 水平比其他患者显著升高，并且AI准确提示了满足 KCC模型的患者肝脏有更多的坏死改变[11-12]。然而，在使用 ELISA 时，需要CK18 和 cc-CK18 水平高于一定的基线水平；如果K18 和 ccK18 水平较低，或接近背景水平时，该比率可能无临床意义。

(六)脂肪酸结合蛋白(FABP1) FABP是一类小分子蛋白，主要通过与疏水性配体，如各类脂肪酸、花生酸等脂质结合，在脂质的代谢等过程中发挥重要作用。现已发现至少9种FABP成员，FABP1命名为肝脏型，FABP参与脂质代谢，其表达在人体内绝大多数细胞组织内会随着脂质沉积而表达增高。2019年的一项多队列DILI潜在生物标志物筛选研究就提出，包括FABP1在内的一些生物标志物的AUC>0.9，且灵敏度较高，具有良好的生物标志物潜力，可以考虑用于DILI筛查[13]。

三、转录组学

(一)微小RNA 微小RNA(miRNA)是小片段(20～24核苷酸)非编码RNA，常参与基因表达转录后的调控。

迄今为止，已有研究证实了肝损伤期间血清miRNA的浓度变化[14]。MiR-122和MiR-192经研究证明在小鼠APAP肝损伤后会显著升高，并在研究中发现，人类受试者中也表现出类似增加。而在临床上APAP过量摄入后入院的患者中也发现了在肝细胞损伤的早期阶段可以检测到血清miR122，而传统标志物ALT仍处于正常水平[9]。

此外，miR-122比ALT更具肝脏特异性。研究人员在大量运动诱导受试者肌肉损伤的实验中发现，受试者的血清miR-122保持相对的稳定，而ALT却能明显检测到增加[15]。然而，miR-122对特异性DILI的预测价值仍有待确定。尽管miR-122作为早期血源性DILI生物标志物能够提供有效的信息，但无论是在大鼠还是在人类中，过量服用APAP后，尿液的miRNA水平都不会显著增加。因此其是否在临床上有普遍应用价值仍需进一步确认。

(二)外泌体 外泌体(exosomes)是一种由各类细胞以膜结构分泌的细胞外囊泡(EV)，近年来作为细胞间通讯的重要组成部分而备受关注。现有研究表明， APAP 诱导的DILI使得miR-122 和 miR-192的水平升高，而没有增加肾脏特异性 miR-146a 或肌肉特异性 miR-206，表明 EV-miR-122/192可能同样具有肝脏特异性[16]。同时，也有研究显示，EV-miR-122 比循环中的游离miR-122 更稳定，并对 RNA 酶具有一定抗性[17]。但EV-miR-122 作为生物标志物仍然存在一定局限性。例如现有研究无法证明其作为DILI的生物标志物方面相较于血清中游离的miR-122是否有更多优势，且EV-miR-122和游离miR-122同样具有高度可变性。

尽管外泌体作为DILI信号标志物已有一定研究进展，但现有研究仍然强调对外泌体的基本功能与调节机制缺乏了解。并且正如上文中所提到的那样，这些包裹在外泌体中的蛋白或RNA分子是否比游离态的对应分子在DILI的生物标志物方面有更多优势还有待研究。

四、药物基因组学

药物或其活性代谢物介导DILI发生的机制多种多样，例如传统的药物介导肝细胞损伤导致的固有免疫系统细胞因子风暴、适应性免疫系统导致的持续性肝损伤。同时还有半抗原假说和HLA相关的遗传变异。由肝脏代谢产生的药物或药物代谢物可作为“半抗原”被抗原呈递细胞识别作为抗原加工。随后在MHC II类分子的肽沟中呈递衍生片段激活CD4 + T细胞，由受损肝细胞释放细胞因子及其他因子共同刺激危险信号通路，从而促发DILI相关的免疫反应。

(一)半抗原假说 药物或其活性代谢物由于其本身的结构性质可以与肝脏蛋白质共价结合，形成的药物-蛋白质复合物可以通过巨噬细胞的抗原递呈作用引发免疫反应，例如氟烷和泰尼酸介导的抗LKM抗体(肝脏和肾脏内质网微粒体抗体)形成。然而有观点认为，半抗原可能还需要一些伴随的危险因子才能介导免疫损伤，例如感染或炎症等。因此，大多数引起DILI的药物其损伤机制与药物肝代谢产生的半抗原复合物无关。

(二)人类白细胞抗原(HLA) HLA的基因型已被许多研究证明与DILI相关(见表2[18-20])。

表1 DILI相关的HLA基因型

尽管已证实药物是否引发DILI与HLA基因型相关，但仍有研究指出HLA基因型对DILI的阳性预测价值仍然非常有限，例如HLA-B*5701与氟氯西林诱导的 DILI 已经被证明具有相当强的关联性，其阳性预测值也仅为 0.12%。同时，HLA 基因型检测同时有低阳性预测值和成本高昂的缺陷。我国2019年的一项前瞻性队列研究发现， HLA-B*35:01是 PM-DILI 的高风险等位基因(PM-DILI 与其他 DILI，OR86.5；PM-DILI 与人群对照，OR 143.9)。在前瞻性队列研究中，6 例患者被诊断为转氨酶水平无症状升高，代表 HLA-B*35:01 中发生率显著升高(相对风险8.0)携带者 (37.5%) 高于非携带者 (4.7%)。HLA-B*35:01 等位基因是 PM-DILI 的遗传危险因素，也是预测人类 PM-DILI 的潜在生物标志物[21]。

(三)非HLA位点突变 有研究通过PBMC 与 HepG2 肝癌细胞的共培养对77 种随机选择的具有不同 DILI 风险的已上市或已撤回药物进行测试得出有预测DILI潜力的单基因或基因组合[22]。ROC分析显示，单基因中MET的AUC值最高(0.81)，其次是BMP6(0.76)、IL-24(0.73)、CXCL8(0.72)和EREG(0.67)，并且都具有显著性。该项研究还指出，MET 表达水平可以区分相同药物类别中的一些 DILI 阳性药物和 DILI 阴性药物。同时该研究使用9个已鉴定的生物标志物基因，对 BMP6、EREG、IL-1A、MET、PID1、PTGS2、SLC7A11、SLPI 和 TNFAIP6 表达水平进行建模。该模型在区分 DILI 阳性药物和 DILI 阴性药物方面提供了最佳预测(AUC=0.94，灵敏度为 93%，特异性为 86%)。该研究提供了可以预测或评估DILI的免疫细胞系列单基因及基因组合。然而这些基因与 DILI 之间存在统计学上的关联，但缺乏机制上的研究佐证。另一项通过全基因组 DNA 甲基化分析，MassARRAY在 296个病例中验证了 34 个已识别的候选探针[23]。结果发现，7个探针上的12个CpG位点与ATLI风险呈正相关。有研究者应用CRISPR/Cas9基因编辑技术介导的甲基化可修饰细胞模型，证明AK2基因区域内或附近的四个CpG?，SLC8A2和PSTPIP2影响细胞对利福平治疗的反应程度，提供了与 ATLI 发生相关的新生物标志物。

五、代谢组学

一些可疑药物，如曲格列酮、非阿尿苷可引起线粒体损伤。这一过程可导致血清或尿液中内源性代谢产物的产生，代谢产物的出现可先于线粒体功能的恶化，是识别和预测不良结局的潜在生物标志物。在代谢组学研究中有两个较为经典的案例，一项对乙酰氨基酚(APAP)诱导肝毒性的研究发现在整合了尿液代谢产物的数学模型中，NAPQI是DILI易感性的一种重要预测因子，NAPQI产生越多，发生DILI的风险也越高[24]。该研究显示了无偏倚代谢组学在评估内源性和药物诱导性生物标志物中的重要价值。另一个研究是服用土三七导致肝小静脉阻塞综合征的患者中，通过超高液相色谱-质谱显像法在DILI患者血清中发现吡咯烷生物碱[25]。

六、抗药抗体

根据之前的报道，一些DILI造成的肝损伤可能是由抗药抗体介导的免疫杀伤。药物如替尼酸和氟烷引起的异质肝损伤就与多种抗体有关。联系前文的半抗原学说，药物可以与MHC分子结合诱导免疫反应，或本身作为抗原以可逆方式与免疫受体相互作用，即“药物与免疫受体的药理学相互作用(p-i)”。一些研究通过检测免疫药物反应患者的 T 细胞克隆表型，一些药物(包括磺胺甲恶唑、卡马西平、阿巴卡韦、和青霉素)已被证明可以与MHC直接产生相互作用并刺激活化T细胞。抗药抗体的相关研究或许有助于DILI的检测，未来可能为DILI生物标志物的研究带来新的见解。

七、药物淋巴细胞转化试验(LTT)在DILI诊断中的意义

日本早在1978年根据过敏特异质性DILI的发病机制，提出了药物淋巴细胞刺激试验(DLST)，与后来在DILI诊断中使用的淋巴细胞转化实验(LTT)实质上并无区别。LTT 是一种体外淋巴细胞增殖试验。试验人员用氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)对来自可能因药物引起的DILI患者的外周血单个核细胞 (PBMC) 进行DNA标记，并与可能导致DILI的药物共同孵育，最后测量淋巴细胞增殖水平以判断是否药物引起特异性免疫反应。

近年来，多项临床试验或分析正在不断证明DLST或LTT在DILI中的诊断价值。一项前瞻性分析研究收集了日本27家医院2010年至2018年间的307例(男125例，女182例)DILI患者数据，结果显示59%的病例接受了DLST，48%的病例呈阳性[26]。2021年，在一项通过主动药物警戒计划检测 COVID-19 患者DILI的研究中，10例患者接受了 LTT，其中 8 例(80%)对可疑药物获得了阳性结果，且所有获得阳性结果的药物的 RUCAM 评分均≥4；同时羟氯喹和阿奇霉素作为COVID-19治疗常用药，是该研究中出现LTT结果阳性最多的药物[27]。对于其他药物超敏反应，例如抗结核药物(ATD)的患者出现皮肤超敏反应，也可在LTT中观察到阳性增殖，可分离出异烟肼/利福平特异性T细胞以证明药物相关超敏反应的潜在机制。临床上也有单病例采用了LTT和Roussel Uclaf 因果关系评估方法 (RUCAM) 同时进行因果关系建立进行尝试[28]。该患者服用糖尿病药物伊格列净(Ipragliflozin)后出现ALT和ALP的升高，LTT结果显示为阳性。

日本肝病学会在2004年的日本消化疾病周(DDW-Japan)将LTT纳入RUCAM因果关系的判定项目。一项2022年的研究评估了LTT在DILI中协助更新RUCAM评估方法的效用，研究结果证明了LTT对于RUCAM的评估方法确实能加强其因果关系评估效用(尤其是针对本身容易导致DILI的药物和肝细胞表型的DILI)，其中149种药物中有46种出现LTT阳性，45例DILI患者中出现34例(75.5%)LTT实验结果阳性，且没有实验对照组LTT阳性，结果表明LTT的敏感度为77%，特异性为100% (SI的最佳截断值为1.95，AUC0.91; 95%CI0.84～0.97;P<0.001)[29]。

尽管LTT作为一个很有潜力的临床指标，但FDA因缺乏多地区、可重复数据的原因尚未批准。也有学者对其存在一定质疑，例如2002年一项包含了从1979年至1999年2 496例汉方相关肝损伤的回顾性研究中，研究者在不参考LTT结果的情况下，评估了汉方药物的使用与肝损伤发生之间是否存在因果关系[30]。而研究者分析得出的“绝对无关”组中的大多数患者对可疑汉方药的 LTT 呈阳性，表明根据 LTT 对汉方药物性肝损伤进行诊断尚不可行。

八、总结与展望

较为传统的DILI生物标志物当前在临床上主要用于评估DILI的严重程度，而eDISH、DILIsym、RO2等数学模型尝试基于传统DILI生物标志物去判断药物肝毒性潜力。但这些传统生物标志物具有其本身的局限性，例如肝脏特异性低、无法在疾病造成实质性肝损伤之前准确提示疾病的发生。GLDH、SDH、GST等新的蛋白标志物相较于ALT都在不同程度上提高了敏感性和特异性，其中HMGB1、CK-18由于其反应更快、特异性更高并且与DILI预后更相关而更加受到关注。转录相关的miRNA以及包裹miRNA的外泌体都具备DILI候选生物标志物的潜力，尤其是miRNA-122已经被证明比ALT更高的特异性，但其对特异性DILI的临床意义以及外泌体形式的miRNA的诊断价值需要后续更多研究进行确认。从基因组学的角度，目前已有至少10种HLA基因型被证明与DILI相关，同时一些非HLA位点的突变尤其是一些生物标志基因组合同样被证明具有DILI的预测潜力。LTT或许是一个有潜力的临床指标，并且确实能加强RUCAM因果关系评估效用，其局限性在于目前尚缺乏多地区、可重复数据提供有力支撑。

综上所述，目前新的DILI生物标志物已经有相较于传统标志物更加高的敏感性与特异性，在后续更多的基础与临床研究的支持下或许能够逐步完善DILI的实验室诊断，增强临床DILI预测能力，进一步降低用药后肝脏不良事件的发生率。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。