富血小板血浆宫腔灌注治疗薄型子宫内膜的研究进展

任军香，韩红敬

(北京大学人民医院妇产科生殖医学中心，北京 100044)

薄型子宫内膜的定义尚无统一标准，临床上推荐当子宫内膜厚度<7 mm时称为薄型子宫内膜。而顽固性薄型子宫内膜定义为至少1次在胚胎移植(ET)周期中经过标准激素替代疗法(HRT)内膜准备子宫内膜厚度仍<7 mm[1]。体外受精-胚胎移植患者(IVF-ET)中薄型子宫内膜发生率为2.4%[2]。子宫内膜厚度<7 mm的患者IVF临床妊娠率为11%[3]，远低于目前平均水平(30%～40%)，并与较高的流产风险有关[4]。薄型子宫内膜人群胚胎植入率低可能与子宫内膜血供较少、维持内膜正常形态的蛋白缺乏、支持细胞脆性增加致妊娠囊失去物理支撑而剥离等有关。患者体内低雌激素水平、先天的子宫畸形、既往宫腔操作史、盆腔感染引发的子宫内膜炎、长期服用避孕药、长期不良生活习惯等均可导致薄型子宫内膜。目前临床上常用大剂量雌激素补充，联合低剂量阿司匹林、维生素E、血管活性药物(如西地那非)、细胞集落刺激因子(G-CSF)以及神经肌肉刺激等[5]方法改善子宫内膜厚度及血流，但仍有部分顽固性子宫内膜薄型患者对以上方案不敏感。顽固性薄型子宫内膜的治疗是临床工作中亟待解决的问题。

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)被定义为“血小板浓度是正常水平的4～5倍的自体血液中的血浆成分”。PRP为自体外周静脉血离心提取获得。20世纪70年代即已开展了PRP应用于创伤修复中的研究，目前已广泛应用：骨科在磨碎的骨移植物中添加PRP以提高成骨速率；整形外科在创伤性瘢痕修复、生发、游离皮片移植中的应用；皮肤科脱发、难愈性伤口的治疗等。PRP的医疗价值与生物安全性得到了临床的认可与验证，但其在妇产科的应用仍在起步阶段，自2015年起PRP改善薄型子宫内膜患者的临床妊娠结局方面的研究开始出现。目前大部分研究结果显示PRP可改善薄型子宫内膜的妊娠结局，小部分研究结果提示PRP改善薄型子宫内膜的作用不明显。本文对此方向的研究进展进行综述，以期促进研究者对薄型子宫内膜宫腔灌注PRP开展高质量研究，并推动薄型子宫内膜患者PRP宫腔灌注的临床应用。

一、PRP的制备及优势

Marx[6]将PRP中血小板的有效浓度定义为1×106/μl。通过提取血液制品成分促进组织再生和修复已有40余年的历史，PRP的制备也经历了一代和二代。其中二代PRP的制备较一代在功效和性价比方面有了质的提升。但目前临床制备PRP的方式参差不齐[7]，有待统一。也有研究者认为盲目采用文献中报道的离心方法是不可取的，需制定与具体的仪器设备相配套的制备方法[8]。

(一)PRP的制备方法

1.一代PRP的制备：在预装有柠檬酸盐抗凝溶液(ACD-A)的注射器中抽取一定量新鲜采集的外周静脉血，通过离心去除血液的某些成分来增加血浆中血小板的浓度。添加血小板激活剂使血小板中的生长因子和细胞因子在凝血后10 min内激活并释放，这些因子协同发挥调节细胞迁移、附着、增殖/分化以及促进细胞外基质积累的作用。全血采集量需根据所需PRP用量及患者基础血小板浓度来评估。1 ml PRP的制备需要的全血量大约为5～10 ml，甚至更多[9]，一般宫腔灌注PRP课题需要制备5 ml左右。不同文献中PRP的制备方法也不尽相同，包括离心速度、离心时间及离心次数的差异，主要影响PRP中不同成分的含量，从而影响PRP的功能。因此需要统一PRP的制备方法才能缩小因制备方法不同引起的对妊娠结局影响的误差。

2.二代PRP的制备：以Choukroun离心方法[10]为标准，将采集的静脉全血以2 700 r/min，离心12 min(亦有3 000 r/min离心10 min)的方式离心后分3层，上层为血小板贫乏的血浆(PPP)，中层为二代PRP，下层为红细胞层。制备过程中应注意采血后立即离心；制备完成后立即进行宫腔灌注，其生物活性更高。

二代PRP又称有白细胞的富血小板纤维蛋白(L-PRF)，它与一代PRP的不同点在于所含细胞成分比例及纤维蛋白构架不同。在离心的过程中离心速度越快则形成的纤维蛋白网越致密有序。二代PRP仅一次离心，一代PRP需要经过两次较二代PRP速度低的离心，且第一次离心后会弃掉上层部分纤维蛋白原。因此二代PRP相较于一代有以下优势：(1)能发挥更高的生物学效应。其内含白细胞及其他一些细胞因子能提高子宫内膜的抗感染及修复能力；(2)不需要额外添加钙离子等促凝剂，仅一次离心，更方便省力且安全；(3)所含纤维蛋白原更丰富，形成的纤维蛋白网更坚固致密、不易被水解，发挥作用时间更久[11]。

(二)PRP的优势

PRP富含多种生长因子，经激活后可以缓慢释放、协同发挥作用，和单一的一次性释放方式相比作用时间更长、具有更强的实际效果。同时，相关研究表明PRP不会造成细胞行为方式的改变，即不会导致细胞恶性变[12]，而且造成宫腔内感染的可能性也极低。此外，PRP来源于患者本身，减少了宫腔组织对因子的排斥作用；更容易获得且成本更低；PRP虽属于血液制品，但血液传播疾病相关风险非常低。

二、 PRP治疗薄型子宫内膜的研究进展

(一)PRP作用于子宫内膜的机制及基础研究进展

PRP宫腔灌注的生物学效应可能与PRP中生长因子的促炎、趋化、促血管生成和抗凋亡作用有关。PRP中血小板浓度及各种生长因子如血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等[13]的浓度提升了4～5倍。这些因子在白细胞向损伤部位的募集、诱导和调节其他参与组织修复的细胞类型(如平滑肌细胞和间充质干细胞)的增殖和迁移、促进血管生成以及成纤维细胞的激活等方面发挥关键作用[14]。这些生长因子在PRP被激活的过程中通过脱颗粒的方式缓慢释放，活化的细胞因子与内膜细胞上相应受体作用激活相关信号通路，可促进人子宫内膜上皮细胞、子宫内膜基质成纤维细胞、子宫内膜间充质干细胞、骨髓源性间充质干细胞的迁移、增殖和分化[15]，从而刺激腺体细胞及血管的增生，促进合成胶原蛋白原，修复损伤组织。除生长因子外，PRP中还含有纤维蛋白、纤维结合蛋白等蛋白质物质，形成纤维网络，起到修复细胞、促进细胞黏附、防止细胞流失的支架作用[16]。

2018年一项PRP刺激子宫内膜细胞再生的体外试验进一步探讨了PRP和PPP对子宫内膜间质成纤维细胞(ESF)、子宫内膜间充质干细胞、骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)和Ishikawa细胞(IC)增殖、迁移和基因表达的影响[15]，该研究发现：活化的富血小板血浆(APRP)、非活化的富血小板血浆(NAPRP)、PPP均有促进子宫内膜细胞增殖和迁移的作用，但APRP的影响最大且作用最一致。另外，由于间充质干细胞(MSCs)中性激素受体的存在及其细胞外基质重塑的能力，MSCs是细胞外基质重塑、血管生成、细胞间通讯和绝经后组织修复的重要细胞成分。MSCs自噬水平降低被认为是BM-MSCs老化的机制之一。在此基础上，Vishnyakova等[17]通过自体PRP与自体普通血浆和完全生长液对从子宫分离得到的MSCs的影响试验，观察到PRP处理后子宫内膜MSCs中自噬标志物LC3B蛋白的表达增加，提示PRP可通过促进自噬从而促进子宫内膜间质细胞的自我更新。

杨耀等[18]在衍生的PRP对子宫内膜间质细胞体外增殖影响的试验中发现，37～41周新生儿脐静脉血中血小板内因子PDGF-AB的含量高于同孕周孕妇外周静脉血中PDGF-AB的含量，此研究还显示低浓度的PRP可呈剂量依赖模式刺激细胞的增殖和迁移，超过一定浓度范围则抑制细胞增殖，且2% PRP剂量时细胞增殖最强[19]。因此，PRP的剂量浓度与其临床疗效密切相关，提示找到最适宜宫腔灌注的PRP应用浓度临床意义重大。

(二)PRP作用于子宫内膜的动物实验研究

薄型子宫内膜动物模型(无水乙醇处理大鼠宫腔)内膜表面平整、腺体及血管不可见，内膜功能层菲薄几近消失[20]。研究表明，将PRP灌注于经无水乙醇处理的大鼠宫腔中，既可提高标志子宫内膜容受性的相关蛋白，如波形蛋白(vimentin)、整合素β3、VEGF、同源盒基因-A10(HOXA10)以及细胞增殖相关的核蛋白Ki-67的表达，改善子宫内膜对胚胎的接纳能力[20]；又可降低促炎症细胞因子IL-1 mRNA的表达水平，降低炎症反应[21]；还可提高子宫内膜波形蛋白的表达，维持子宫内膜细胞骨架的完整性[20]。经PRP宫腔灌注后大鼠宫腔内膜表面呈波浪型，可见腺体及小动脉增生。子宫内膜损伤导致腺上皮生长不良、子宫血流阻力高、血管生成不良，而PRP可促进子宫内膜损伤后子宫内膜腺体及血管的恢复，减少子宫内膜损伤后纤维化相关因子的表达，抑制子宫内膜纤维化的形成[22]。

(三)PRP治疗薄型子宫内膜的临床研究进展

Chang等[23]在2015年最先开展宫腔灌注PRP治疗薄型子宫内膜的研究，纳入5例既往子宫内膜反应差、应用HRT周期后子宫内膜厚度仍<7 mm的患者，于HRT周期的第10日进行PRP宫腔灌注，若72 h后子宫内膜厚度仍<7 mm则进行第2次灌注。结果5名患者子宫内膜厚度均增加，最终4名患者正常妊娠，1名因胚胎染色体异常流产。该研究为PRP改善薄型子宫内膜厚度方向的研究拉开了帷幕，也用实践第一次证明了PRP宫腔灌注体内试验的安全性。

有研究者比较了PRP和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)宫腔灌注对内膜薄且反复种植失败(RIF)人群冻融胚胎移植(FET)周期妊娠结局影响，发现两种方法在胚胎植入率、临床妊娠率、活产率和流产率方面无显著差异，改善作用相似[24]，但该研究样本量较小，仍有待高质量的随机对照研究验证。另有研究在以上基础上增加了生理盐水宫腔灌注组，结果表明，与生理盐水组相比，PRP及G-CSF宫腔灌注均促进薄型子宫内膜厚度增加及血流改善，但三者之间胚胎种植率、临床妊娠率及早期流产率均未见明显差异[25]。目前也有研究关注PRP宫腔灌注治疗RIF人群的效果，认为宫腔自体PRP输注是一种安全、廉价的优化子宫内膜的辅助治疗，特别是对于有RIF病史的患者。因此RIF或顽固性薄型子宫内膜患者是PRP宫腔灌注的重点适用人群。目前大部分的临床研究得出积极结论，即宫腔灌注PRP能改善薄型子宫内膜人群的妊娠结局。成慧等[26]设计的前瞻性研究显示，FET周期中子宫内膜对HRT反应不良(周期第13天时子宫内膜厚度<7 mm)的女性，在FET周期的第13天将1 ml PRP注入子宫腔，如48 h后子宫内膜厚度未能增加，则在同一周期中重复PRP灌注；对照组仅接受HRT。与未进行宫腔灌注PRP的对照组相比，PRP组的子宫内膜厚度显著增加 [(8.76±0.65) mm vs.(8.04±0.41) mm，P=0.001]，胚胎植入率(21.0% vs. 9.37%)和临床妊娠率(40.5% vs. 20.0%)也显著增高。另一项前瞻性队列研究[27]结果表明，在HRT周期第10天和黄体酮给药日分别经宫腔导管注入PRP，能有效改善子宫内膜厚度[(7.65±0.22) mm vs.(6.52±0.31) mm]、提高临床妊娠率(44.12% vs. 20%)和胚胎植入率(27.94% vs. 11.67%)、降低周期取消率(19.05% vs. 41.18%)，以上结果均有统计学意义。此两项研究代表了目前主流的PRP宫腔灌注时机，虽然PRP宫腔灌注的时机稍有差异，但均间隔2～5 d予PRP宫腔灌注，且均得出子宫内膜增厚、临床妊娠率提高的结论。另一项纳入83例患者的前瞻性研究认为PRP组的胚胎植入率和单周期临床妊娠率均显著高于对照组[28]。齐改梅等[29]的回顾性研究也得出相似的结论。关于PRP宫腔灌注的时机、重复PRP宫腔灌注是否优于单次灌注、2次PRP宫腔灌注最佳时间间隔等问题，仍有待进一步的研究加以阐明并进行验证。

Coksuer等[30]回顾性研究观察到，34例内膜形态不良的RIF患者给予PRP宫腔灌注治疗，内膜厚度增加(10 mm vs. 6.25 mm，P<0.001)；与36例内膜形态良好不需PRP宫腔灌注的患者相比，临床妊娠率(35.2% vs. 22.2%)和活产率(41.2% vs. 16.7%)均显著提高(P<0.05)，而两组间FET后的自然流产率和异位妊娠率相似。此项研究中PRP宫腔灌注不仅弥补了子宫内膜厚度的差异，提高了临床妊娠率，甚至还提高了活产率，可能与血小板中释放的多种细胞因子协同作用提高了子宫内膜容受性有关。活产率的提高是最终体现治疗有效性的指标，目前尚缺乏PRP宫腔灌注治疗薄型子宫内膜对活产率影响的研究。

三、未来展望

综上所述，尽管宫腔灌注PRP改善薄型子宫内膜厚度以及改善临床妊娠结局方面取得了一定的疗效，但依旧存在很多的问题。例如PRP的制备标准、注射剂量、评价指标仍存在很大差异，尚无一致标准。标准化的PRP制备方案对于未来的研究中重现一致和准确的结果至关重要。此外，基础研究证明了PRP在修复子宫内膜损伤的作用机制且发现作用效果与PRP的剂量浓度有关，但PRP在宫腔中作用的半衰期尚无文献说明。临床中部分患者进行一次宫腔灌注后子宫内膜厚度改善仍不理想者需第二次宫腔灌注，其中两次灌注的时间间隔对于子宫内膜厚度的影响仍有待阐明。因此研究PRP的浓度梯度、宫腔灌注的次数与时间间隔对薄型子宫内膜的影响有利于完善PRP宫腔灌注的临床应用。目前大部分的临床研究样本较小，某些对照变量未控制，且随访时间短，仅获取临床妊娠率，未随访活产率，因此对母儿最终妊娠结局的有效性、安全性及不良影响缺乏有力证据，最终导致临床研究的证据级别较低。因此高质量、设计完善的随机对照研究、体外试验研究仍有待进一步补充完善，为临床应用PRP宫腔灌注治疗顽固性薄型子宫内膜提供更高质量的证据。