活血化瘀祛痰法对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响

郭晓燕，毕蓉蓉，张晔敏，陆城华

(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

肺动脉高压(Pulmonary hypertension，PH)是以肺血管阻力和肺动脉压持续性升高为特征的慢性肺血管疾病，以肺血管内皮功能障碍、平滑肌增殖、纤维化和原位血栓形成为特征，最终导致右心功能不全，甚至死亡，PH是多种并发症的产生的诱因，也是多种疾病发展到一定阶段后出现的病理性变化[1]。其发病机制复杂，治疗困难，预后差，严重程度甚至远远超过了癌症。据估计，与任何病因的PH相关的病死率为女性5.5/10万，男性5.6/10万，从诊断PH起平均存活时间为2～5年[2]。目前临床治疗PH药物包括肺血管扩张剂、内皮素抑制剂、NO激活剂等靶向药物，血管扩张剂可改善患者临床症状，未能有效降低患者病死率。靶向药物能够改善患者生存质量，远期疗效欠佳[3-4]，PH的1年病死率仍然高达15%[5]。PH病理特征是肺血管重构，表现在肺动脉血管内皮损伤、血管中膜增厚等，肺血管腔狭窄、管壁增生甚至血管闭塞，最终引起肺动脉压力增高[6-7]。因此，阻止及逆转肺血管结构重建是治疗PH的关键环节。既往研究显示，中药复方制剂可能通过调节血管舒张功能、保护肺血管内皮功能、抑制肺动脉平滑肌细胞增殖、抑制肺血管重构等机制以改善PH患者肺动脉压力、右心功能等[8-9]。PH属于中医“肺胀”“喘证”等范畴，早期病变首先在肺，早期以痰浊为主，渐而痰瘀互见，终至痰浊、血瘀等错杂为患。吴莹等[10]研究发现痰浊、瘀血是PH病情发展过程中的病理产物和致病因素，活血化瘀祛痰是治疗PH的重要原则。本文基于前期研究，拟采用活血化瘀祛痰法治疗PH，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康SD大鼠，SPF级，体重(200±20) g，饲养于上海中医药大学附属龙华医院动物房。动物许可证号SYXK(沪)2018-0036，环境温度(25±1)℃，湿度28%中适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 实验药物：①中药复方由川芎、赤芍、白芍、当归、丹参、黄荆子等组成，取上述药物制成液体制剂，其浓度为每毫升含生药量1.526 g，由上海中医药大学附属龙华医院制剂室提供。根据成人日服剂量，按动物体表面积比率换算等效剂量，日服量：8.64 g/(kg·d)。②盐酸法舒地尔注射液：规格2 ml:30 mg/支(天津红日药业有限公司)。

1.1.3 主要实验试剂与仪器：多道生理信号采集系统(成都仪器厂)；电泳仪(BIO-RAD公司)；转膜仪(BIO-RAD公司)；酶标仪(Thermo公司)；DMEM/F-12(Gibco)；抗生素(青链霉素)(Gibco)；FBS(Gibco)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)；胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶(Gibco)；超低温冰箱(Haier)；倒置显微镜(Olympus)；超净工作台(Baker公司)；Marker(Thermo公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备：采用野百合碱(MCT)腹腔注射建立肺动脉高压模型。大鼠腹腔内一次性注射MCT50 mg/kg，观察3周。

1.2.2 分组与给药：SD大鼠按随机数字表法随机分为四组，分别为假手术组、模型组、中药复方组、法舒地尔组，每组15只。各组均从第1天起开始给药，中药复方组给予中药 8.64 g/(kg·d)灌胃，法舒地尔组给予盐酸法舒地尔注射液15 mg/(kg·d)腹腔注射，假手术组和模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃，每日1次，持续3周。

1.2.3 取材与处理：脱臼法处死大鼠后取出肺脏，以0.9%氯化钠溶液冲洗后剪取右外上肺叶，浸泡于4% 多聚甲醛缓冲液固定，制备肺组织病理标本。

1.3 观察指标

1.3.1 一般状态：观察各组大鼠一般状态、体重、呼吸、活动状态。

1.3.2 肺动脉压：采用大鼠行右心导管术测定大鼠肺动脉压[11]，将大鼠用3%戊巴比妥钠麻醉后，颈部正中作长约1.5 cm的纵行切口，并游离右颈外经脉约1 cm，结扎，剪口，用一充盈肝素溶液的聚乙烯管经颈静脉缓慢插管至右心房、右心室及肺动脉，导管另一端连接压力传感器到生物信号采集系统，根据压力波形确定测导管位置，记录平均肺动脉压力(mPAP)。

1.3.3 右心指数：测定肺动脉压力结束后，立即完整取出心脏和肺脏，分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+S)，并依次称重，计算右心肥大指数(RVHI)=RV/(LV+S)。

1.3.4 肺组织病理：大鼠右肺中叶组织4%多聚甲醛固定24 h，行HE染色观测模型肺组织的病理改变、维多利亚蓝+VG特殊染色观察肺血管重建指标。采用Image J图像分析软件测量血管内径(D1)、外径(D2)，计算肺动脉血管壁厚度百分比(WT%)，WT%=(D2-D1)/D2×100%。

1.3.5 ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表达：采用Western blot法检测。常规提取组织蛋白,使用考马斯亮蓝法进行蛋白定量,SDS-PAGE 电泳、转膜,一抗结合和二抗结合[一抗为鼠抗Rho 抗体(Thr696,1∶1500)、兔抗ROCK 抗体(1∶1000)抗体和兔抗DAPDH 抗体;二抗为生物素标记的山羊抗小鼠IgG 或者山羊抗兔IgG (1∶800稀释)],曝光、显影、定影。以GAPDH 为内参照,应用图像分析软件进行条带扫描分析,目的蛋白显色条带灰度与GAPDH 显色条带灰度比值代表目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行统计。数据以均数±标准差表示，对数据进行正态分布检验，符合正态分布者采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，不符合正态分布者，采用非参数检验；检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态及体重比较 注射MCT4周后大鼠一般情况发生变化，动物活动能力下降，毛发晦暗、缺少光泽，呼吸急促加快，易激惹，食欲下降，逐渐消瘦。模型组、中药复方组、法舒地尔组均已出现明显体重下降、呼吸急促等表现。结果显示，模型组较假手术组体重明显降低(P<0.01)，中药复方组、法舒地尔组体重较模型组升高(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠肺动脉压力比较 模型组mPAP明显高于假手术组(P<0.01)，中药复方组、法舒地尔组mPAP均低于模型组(P<0.01)，法舒地尔组与中药复方组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠右心指数比较 模型组RVHI均明显高于假手术组(P<0.05)，中药复方组、法舒地尔组大鼠右心指数均低于模型组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠体重、右心指数、mPAP比较

2.4 各组大鼠肺血管重构比较 假手术组大鼠肺泡完整，肺小动脉血管壁光滑无增厚，管腔无狭窄，血管内皮细胞分布均匀，连续性完整；模型组大鼠肺中动脉血管壁明显增厚，管腔狭窄，中层平滑肌细胞增殖肥大、排列紊乱。模型组肺中动脉管腔狭窄、中膜增厚程度较对照组明显(P<0.01)，中药复方组、法舒地尔组血管增殖程度较模型组减轻(P<0.01)。见图1、2。

图1 各组大鼠肺动脉血管病理变化(HE染色，×400)

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01图2 各组大鼠血管壁厚度百分比比较

2.5 各组大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ表达水平比较 与假手术组比较，模型组ROCKⅠ、ROCKⅡ水平均较假手术组明显升高(P<0.05或P<0.01)；中药复方组、法舒地尔组ROCKⅠ、ROCKⅡ水平低于模型组(P<0.05或P<0.01)；中药复方组ROCKⅠ、ROCKⅡ水平与法舒地尔组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01图3 各组大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白水平表达比较

3 讨 论

PH患者肺动脉内皮细胞功能失调、PASMCs增生、肺血管收缩和原位血栓形成，导致组织缺氧，血液黏滞度增加，肺络瘀阻，呈现局部瘀血阻滞状态。徐欣等[12]基于文献研究显示，PH中医证候主要为肺肾气虚证、痰瘀阻肺证。翟佳滨等[13]认为气滞、痰阻、血瘀为本病的主要病理产物。从上述研究看出，PH属于本虚标实之病，痰瘀阻肺是其标，正气亏虚是其本证型，活血化瘀祛痰是其主要治疗原则。本研究方药由川芎、赤芍、丹参、当归、白芍等组成，具有活血化瘀、化痰止咳平喘等作用。现代研究显示，川芎有效成分川芎嗪具有保护血管内皮损伤、抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移等作用[14-15]。丹参酮ⅡA对PH的保护主要通过抑制肺血管异常收缩、肺血管重构，改善肺部血管炎症反应，改善右心室功能等发挥作用；芍药苷具有抗凝血、扩血管作用[16]；当归提取物当归注射液可抑制肺小动脉管壁增厚，降低肺血管压力[17]。MCT在体内经肝脏代谢成为有生物活性的脱氢野百合碱，选择性地引起肺动脉内皮细胞损伤和凋亡，促进内源性NO的合成分泌降低，缩血管物质释放增加，导致肺动脉持续收缩，诱导肺动脉血管重构，导致PH[18]。MCT诱导的PH模型可见明显血管内皮细胞损伤、肺动脉血管平滑肌细胞增殖、动脉管壁明显增厚，肺血管重构[19]。本研究显示,经MCT腹腔注射诱导后，模型组大鼠动物活动量减少，呼吸急促加快、烦躁，食欲下降，体重减轻，肺动脉压力、右心指数均较假手术明显升高，肺血管WT比例较假手术组增加，中药复方组、法舒地尔组均较模型组大鼠体重升高，肺动脉压力、右心指数下降，肺血管WT比例降低，表明中药复方能够降低MCT诱导的PH，减轻右心负荷，抑制肺动脉血管的增殖。导致肺动脉高压血管重构的机制有K+离子通道、Rho激酶信号通路、BMP信号通路等[20]，其中Rho激酶相关通路在肺血管重构中具有重要作用，Rho激酶存在两种同源性极高的异构体形式 (Rokα/ROCKⅠ 和Rokβ/ROCKⅡ)，激活的Rho 激酶可对其底物肌球蛋白磷酸酶进行磷酸化修饰，引起细胞骨架重组，促进血管平滑肌收缩，平滑肌细胞的迁移、增殖，导致肺动脉高压血管重构[21]。Rho激酶信号介导PASMC和EC中的细胞骨架重排，Rho激酶(ROCK)信号通路在介导所有PH模型中的血管收缩中起核心作用，Rho激酶抑制剂能防治MCT诱导的和基因易感型的大鼠PH，从而改善内皮依赖性的血管舒张，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖并促进其凋亡，促进肺血管收缩和肺血管结构重建，参与PH的发病过程。本研究显示，MCT诱导后，与假手术组比较，模型组ROCKⅠ、ROCKⅡ表达明显增加，给药后中药复方组、法舒地尔组ROCKⅠ、ROCKⅡ表达水平较模型组明显下降，中药复方组与法舒地尔组比较，差异无统计学意义，表明活血化瘀祛痰法可以抑制Rho激酶信号通路的激活，抑制PH血管重构。