黄芪多糖对过敏性鼻炎大鼠Treg/Th17细胞免疫平衡和炎症因子的影响

刘顺利,梁萌萌,刘大英,何 伟,王庆金

(1.河北省沧州中西医结合医院,河北 沧州 061001;2.沧州师范学院,河北 沧州 061001)

过敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)又称变应性鼻炎，是主要由IgE介导的介质释放、并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜变应性疾病，其因过敏源不同分为季节性AR(多为尘螨、脱屑)和常年性AR(多为花粉)，以阵发性喷嚏、清涕、鼻塞、鼻痒为主要临床表现，其病程长、易反复，严重影响患者的生活质量[1-2]。目前，AR的具体发病机制尚不清楚，但一般认为与调节性T细胞/T辅助细胞17(Treg/Th17)免疫失衡、炎症反应密切相关[3]。Treg、Th17均由 CD4 T细胞分化形成，Treg具有免疫抑制作用，可维持机体免疫稳态，可分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)和白介素-10(IL-10)；Th17可招募局部炎症细胞和细胞因子(如IL-17)，诱导鼻部炎性细胞浸润和组织炎性损伤[4-5]。因此，本病治疗过程中如何调节免疫细胞、降低细胞因子水平以及缓解症状至关重要。目前西医治疗AR以药物(糖皮质激素、抗组胺药、白三烯受体拮抗剂)、免疫、手术治疗，上述疗法可缓解患者症状，但是远期疗效不理想，且复发率高[6]。中医认为AR主要为肺气虚弱、卫表不固所致，风寒犯肺、上通鼻窍、邪正相搏、肺气不通、津液停聚、鼻窍壅塞而发为喷嚏、流涕等症，治疗当以补肺固表、宣肺通窍为基本原则。黄芪具有益气固表的作用，黄芪多糖为其有效成分，可显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能。本研究通过建立AR大鼠模型，观察大鼠行为学改变，ELISA法检测血清免疫指标的改变，流式细胞技术检测免疫细胞的分布，探讨其内在的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：5～6周龄SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20)g，动物许可证号SCXK(京)2021-0011，购自北京维通利华实验动物有限公司。饲养环境温度为(25±1)℃，光照12 h，避光12 h，大鼠自由进食、水，定期更换垫料。

1.1.2 实验药物与试剂：黄芪购自河北康博药业有限公司；氯雷他定购自上海麦克林生化科技有限公司；卵白蛋白购自美国Sigma公司；大鼠IgE、IL-10、IL-17 ELISA试剂盒购自联科生物；水合氯醛购自成都市科龙化工试剂厂；氢氧化铝购自美国International Laboratory公司。

1.1.3 实验仪器：HT-300型电子天平(成都倍赛克仪表研究所);BS224S电子分析天平 (德国Sartorius公司);离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);HH-S2S型数显恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)；多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；NovoCyte流式细胞仪 (美国艾森生物)；正置白光拍照显微镜Nikon(Japan)；扫描浏览软件3DHISTECH(Hungary)；全景切片扫描仪3DHISTECH(Hungary)。

1.2 实验方法

1.2.1 AR大鼠模型的建立：以卵白蛋白10 mg、氢氧化铝粉10 mg及0.9%氯化钠溶液1 ml混合后腹腔注射，隔日1次，连续7次，作为基础致敏。第15天起进行加强免疫，给予5%卵白蛋白50 μl滴鼻和1%卵蛋白喷雾吸入10 min(3 ml/min)，每日1次，连续9 d。

1.2.2 黄芪多糖的提取方法：取适量黄芪粉碎，过筛后取100 g粗粉+800 ml水煎煮3次，将水煎液合并，浓缩为200 ml后，加入95%乙醇800 ml，4 ℃过夜，3000 r/min离心5 min，用水溶解沉淀，定容为200 ml，得黄芪多糖。

1.2.3 分组和给药：将50只SD大鼠随机分为空白组、模型组、氯雷他定组(0.90 mg/kg)、黄芪多糖低剂量组(800 mg/kg)、黄芪多糖高剂量组(1600 mg/kg)，每组10只。各药物组每天灌胃给药1次，连续7 d，同期空白组和模型组予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃对照。造模结束股动脉抽取血液进行检测。

1.3 观察指标

1.3.1 行为学症状积分：激发后60 min评估大鼠症状积分(总分0～9分)。鼻痒：轻擦几次鼻子1分，一直挠鼻面3分，两者之间2分；喷嚏：1～3个1分，4～10个2分，11个及以上3分；流涕：流涕至鼻前孔1分，超出鼻前孔2分，流涕满面3分。症状积分≥5分为造模成功[7]。

1.3.2 HE染色：将麻醉的大鼠固定在手术台上，取出新鲜鼻黏膜组织，样本经4%多聚甲醛固定，固定状态良好后，修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片，最后镜检。

1.3.3 流式细胞仪测定Treg、Th17占CD4+T细胞百分比：自股动脉取全血2 ml，2 h内进行流式细胞检测。在每个流式上样管中加入100 μl细胞悬液，细胞数约为1×106个，按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原(0.25 μl CD4抗体、1 μl CD25抗体)，用于冷的Buffer或预冷的PBS洗涤细胞，漩涡震荡重悬细胞后加入1 ml的固定液，并在此漩涡混匀，避光4 ℃孵育30～60 min，加入2 ml Buffer工作液离心洗涤细胞并弃去上清液，避光4 ℃孵育30～60 min，加入稀释好的2%的正常大鼠血清100 μl，避光4 ℃孵育15 min，加入稀释好的荧光标记抗体，避光4℃孵育至少30 min，加入2 ml Buffer工作液离心洗涤细胞并弃去上清液，重复洗涤，上机检测，并计算Treg、Th17细胞占CD4+T细胞的比例。

1.3.4 血清IgE、IL-10、IL-17含量：采集大鼠血液并离心3000 r/min离心15 min，每孔加入200 μl封闭液，37 ℃孵育1～2 h，小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3～5遍。加适当稀释的待检样品100 μl于上述已包被的反应孔中。用封板膜封板后置37 ℃孵育1～2 h，小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3～5遍。于各孔中加稀释好的生物素化抗体工作液100 μl，用封板膜封板后置37 ℃孵育1 h，小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3～5遍。也可以手动洗板：弃去液体，每孔加入300 μl洗液，浸泡1～2 min，在吸水纸上拍干，重复3～5遍。于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100 μl，用封板膜封板后置37 ℃避光孵育30 min，小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3～5遍。于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37 ℃避光反应10～30 min，直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止，于各反应孔中加入2 mmol/L硫酸100 μl，颜色由蓝色变为黄色，10 min内，在酶标仪上，于450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学积分评定 见表1。造模前各组大鼠行为学积分比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模后，与空白组比较，其余四组在造模后行为学积分均明显升高(P<0.05)，说明AR模型造模成功。治疗后，各给药组与同期模型组比较，行为学积分均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；黄芪多糖低、高剂量组治疗效果优于氯雷他定组(P<0.05)，黄芪多糖高剂量组优于低剂量组(P<0.05)。

表1 各组大鼠治疗前后行为学积分比较(分)

2.2 各组大鼠鼻黏膜组织病理学观察 HE染色结果(图1)显示：空白组大鼠鼻黏膜组织无明显变化,上皮细胞完整无破坏。模型大鼠鼻黏膜上皮细胞部分脱落，细胞核被浅染，固有层增厚，细胞间质表现为充血和水肿，炎性细胞浸润。氯雷他定组、黄芪多糖低剂量组、黄芪多糖高剂量组鼻黏膜组织上皮组织较为完整,有少量的炎性浸润。

图1 各组大鼠鼻黏膜病理表理(HE染色，×200)

2.3 各组大鼠血清IgE、IL-10、IL-17含量比较 见表2。与空白组大鼠比较，模型组大鼠的IgE、IL-17水平升高，IL-10含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，与模型组比较，各给药组IgE、IL-17含量降低，IL-10含量升高(P<0.05)，黄芪多糖高剂量组治疗效果优于其他两组 (P<0.05)。

表2 各组大鼠血清IgE、IL-10、IL-17含量比较

2.4 各组大鼠全血Treg、Th17细胞比例比较 见表3。与空白组大鼠比较，模型组大鼠的Treg降低、Th17升高，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，与模型组比较，各给药组Treg升高、Th17降低(P<0.05)，黄芪多糖高剂量组治疗效果均优于其他两组 (P<0.05)。

表3 各组大鼠全血Treg、Th17细胞比例比较(%)

3 讨 论

目前，临床上治疗AR多为西常规治疗基础上加用中药治疗，中药复方、单味中药、中药内服或外用提取物均取得了不俗的疗效，例如玉屏风散、桑菊饮、黄芪、苍耳子等，上述药物和疗法均可有效缓解患者鼻塞、喷嚏、流涕等症状[8]。AR的发病与多重因素相关，机体免疫失衡与其密切相关，其中Th17/Treg失衡在其发病发挥重要作用[9]。Th17细胞、Treg细胞均为人体免疫的重要组成部分，Th17细胞是可分泌IL-17、IL-22的T细胞亚群，并可招募炎性细胞(尤其中性粒细胞)；Treg细胞是抑制T细胞的亚群，起负向调节作用，可分泌IL-10和TGF-β等，下调效应T细胞等多种细胞功能，二者功能大致相反[10]。正常情况下，两种细胞维持一定动态平衡从而稳固机体免疫，病理状态下，其可促进组织损伤、自身免疫病理损伤或自身免疫性疾病[11]。IL-17是一种具有强大的招募中性粒细胞功能的前炎性细胞因子，能够促进多种细胞释放炎症因子，Th17 细胞通过产生大量的IL-17，招募中性粒细胞和诱导趋化因子CXCL8(IL-8)的产生，促使气道黏液腺分泌大量黏液，增加气道的高反应性，从而在多种气道变态反应疾病中气道重塑的过程中发挥重要的作用[12]。 IL-10可抑制炎症因子合成和抑制嗜酸性粒细胞、肥大细胞释放组胺、白三烯等物质，减轻炎症反应[13]。IgE是AR最重要的监测指标，当患者接触变应原后，机体辅助性T细胞(Th细胞)活化并产生免疫应答，激活B细胞形成变应原特异性IgE，且IgE又与其受体相互交联，释放组胺、缓激肽等炎性介质，促使炎细胞因子和嗜酸性粒细胞异常表达[14-15]。本研究结果显示，黄芪多糖低、高剂量组疗效均优于氯雷他定组。

中医认为气虚弱、卫表不固、风寒乘虚而入为AR的基本病机，《证治要诀》说：“清涕者，脑冷肺寒所致。”治疗关键为补肺固表、宣肺通窍。本研究使用的黄芪多糖为黄芪提取物，黄芪具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌之功，《本草汇言》云：“补肺健脾、实卫敛汗、驱风运毒之药也”，《雷公炮制药性解》云：“味甘，性微温，无毒，入肺、脾二经，内托已溃疮疡，生肌收口，外固表虚盗汗，腠理充盈”。现代药理学表明，黄芪含有多糖、黄酮类、三萜类等多种有效成分，具有调节机体免疫和代谢、保护神经和心脑血管系统的作用[16]。黄芪多糖为黄芪的有效成分之一，同样具有调节免疫、增强免疫的功效，且已有研究显示，黄芪多糖可缓解AR大鼠症状和病理改变，从而逆转鼻部黏膜组织的重塑[17]。一项大鼠实验表明，黄芪甲苷通过抑制高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4/核因子κB通路降低IL-4、IL-6等多种炎症因子水平[18]。研究表明，黄芪多糖可改善AR豚鼠模型的症状、病理改变，其机制可能与调节Th17/Treg水平，以及相关细胞因子牛叉头型基因P3和维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)的表达相关[19-20]。本研究模拟临床中、西医治疗方案，探究了氯雷他定组、黄芪多糖低和高剂量组对AR模型大鼠的治疗作用，结果显示黄芪多糖能够有效缓解大鼠症状，其机制可能与调节大鼠Th17/Treg平衡、改善炎症因子表达相关。本研究论证了黄芪多糖对AR大鼠的治疗作用以及其对机体免疫和炎症细胞表达的干预调控，但对其免疫和炎症上下游分子机制仍不明确，仍需进一步设计相关分子实验验证其具体机制，为黄芪多糖治疗AR的临床应用提供理论依据。