不同氮水平下AM真菌对油茶幼苗生长、根系形态和光合特性的影响

黄雨轩，叶 媚，熊 静，沈辉龙，黄伟豪，张林平，吴 斐

（江西农业大学a.林学院；b.鄱阳湖流域森林生态系统保护与修复国家林业和草原局重点实验室，江西 南昌 330045）

油茶Camellia oleifera隶属山茶科Theaceae，为常绿小乔木或灌木，是我国特有的木本油料树种[1]。茶油富含不饱和脂肪酸，被誉为“东方橄榄油”[2-3]。由于全国油料作物种植面积持续下降，国内食用植物油供给缺口不断扩大，发展油茶产业是保障国内油料供给、缓解粮油争地的有效途径[4-6]。油茶主要分布在酸性红壤地区，土壤养分匮乏，而油茶林对氮的需求量大，氮肥的低利用率是油茶集约化生产中的主要问题[7]，不仅增加了经营成本，还因活性氮流失对环境造成负面影响。

丛枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）真菌隶属球囊菌门Glomeromycota，能与大约80%的陆生植物根系形成共生体[8]。大量研究结果表明，AM真菌对植物进行光合作用和生长具有积极作用，为了减少化肥施用量，AM真菌作为生物菌肥的潜力受到广泛关注[9-10]。张学林等[11]的研究结果表明，不同氮肥用量下，接种AM真菌可以改善玉米Zea mays根系特性，增强其氮素吸收能力。孔垂豹等[12]的研究结果表明，在减量施肥水平下接种AM真菌对甘蔗Saccharum生物量的提高作用显著高于常规施肥水平。韦正鑫等[13]的研究结果表明，AM真菌可以显著提高滇重楼Paris polyphylla的光合作用强度，但不同AM真菌的接种效果存在差异。油茶是菌根植物，前人的研究结果表明，AM真菌可以通过改善油茶的根系结构，促进油茶对矿质元素的吸收，增强油茶叶片的光合作用[14]。目前，有关不同氮水平下AM真菌对油茶生长影响的研究鲜有报道。本研究中通过盆栽试验，探究不同氮水平下，2种AM真菌对油茶幼苗生长、根系形态和光合特性的影响，旨在了解促进油茶生长的最佳氮水平和AM真菌，为AM真菌作为生物菌剂的研发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1）植物。选用高产油茶品种长林53作为供试植物，种子采自江西星火农林科技发展有限公司。2020年12月将种子用0.1%的KMnO4进行表面消毒5 min，并埋藏于灭菌沙中催芽。待种子萌发，选取长势一致的幼苗作为研究对象。

2）菌种。幼套近明球囊霉Claroideoglomus etunicatum和摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae购自长江大学根系生物学研究所，使用玉米和三叶草Trifolium pretense作为宿主植物，以灭菌沙为基质，进行扩繁。菌剂包括菌丝、孢子（34个/g）、宿主根及基质。

3）基质。供试土壤采自江西农业大学校园内，为红壤土。土壤基本理化性质：pH值6.2，有机质含量22.35 g/kg，有效磷含量2.30 mg/kg，铵态氮含量8.75 mg/kg，硝态氮含量2.04 mg/kg。土壤过筛（2 mm），经高温灭菌（121 ℃，2 h）处理，消除土著微生物的干扰。河沙过筛（2 mm），用自来水冲洗干净，晾干后干热灭菌（180 ℃，4 h）。供试基质为灭菌土和灭菌沙（体积比1∶1）的混合物。

1.2 试验设计

采用双因素试验设计：3个AM真菌水平（不接种、接种F.mosseae、接种C.etunicatum）；4种氮浓度水平（0、3.75、7.50、15.00 mmol/L NH4NO3）。共12个处理，每个处理重复20盆，共计240盆。每盆装基质1 800 cm3。在接种处理中加入60 g菌剂；不接种处理中加入等量灭活菌剂（121 ℃，2 h），同时加入10 mL菌剂过滤液（1 μm尼龙网）。

2020年5月，每盆植入1棵油茶幼苗，确保根系与菌剂接触。将盆栽放在江西农业大学基地大棚内，温度25～28 ℃，相对湿度70%～75%。施氮处理前，每个月浇灌200 mL 1/4 Hoagland 营养液（136 g/L KH2PO4、101 g/L KNO3、236 g/L Ca(NO3)2·4H2O、246.5 g/L MgSO4·7H2O、 2.86 g/L H3BO3、1.81 g/L MnCl2·4H2O、0.22 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CuSO4·5H2O、0.02 g/L H2MnO4·H2O、7.354 g/L C10H12O8N2NaFe）。

培养3个月，待AM真菌与油茶形成良好共生关系，开始施氮处理。每隔6 d分别浇灌200 mL浓度为 0、3.75、7.50、15.00 mmol/L的NH4NO3溶液，并配施1/4无氮Hoagland营养液（87 g/L K2SO4、115 g/L CaCl2、136 g/L KH2PO4、246.5 g/L MgSO4·7H2O、2.86 g/L H3BO3、1.81 g/L MnCl2·4H2O、0.22 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CuSO4·5H2O、0.02 g/L H2MnO4·H2O、7.354 g/L C10H12O8N2NaFe），共浇灌10次，再培养1周后收获，待测。

1.3 指标测定

1）AM菌根侵染率。参照Phillips等[15]的方法，每个处理随机选取5株，将根系进行透明、软化、酸化、染色、脱色和制片，采用放大十字交叉法统计AM真菌侵染率（具有菌根结构的交叉点数量占总交叉点数量的百分比）。

2）形态指标。使用卷尺测量油茶植株的高度，使用游标卡尺测量地径。使用Espon Perfection V700 Photo型扫描仪对油茶幼苗整体根系进行扫描，使用WinRHIZO（Pro2012）根系软件分析根系形态。

3）气体交换参数。每株油茶选取3片健康完整的叶片（顶芽下的第3～5片），使用LI-6400便携式光合仪（LI-COR公司，美国）测定净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）[16]。

4）叶绿素荧光参数。在测定之前，先对植株进行30 min暗处理，每株油茶选取3片完整展开叶，使用PAM-2500便携式调制叶绿素荧光仪（Walz公司，德国），测定最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、非光化学猝灭（qN）和光化学猝灭（qP）。

1.4 数据分析

使用IBM SPSS statistics 20.0软件对数据进行分析，采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）检测接种AM真菌处理、施氮处理及其交互作用对所有测定指标的影响，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）中的 Duncan’s检验法检测不同处理间的差异（P=0.05）。使用Origin 2019软件绘制柱状图。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）进行综合评价，并选出最佳氮水平和AM真菌。

2 结果与分析

2.1 接种AM真菌及施氮对油茶生长和侵染率的影响

不同接种AM真菌及施氮处理下油茶的AM真菌侵染率如图1所示。不接种处理根系未被AM真菌侵染，在不同菌剂间菌根侵染率无显著差异。由图1可见，随着氮浓度的增加，C.etunicatum和F.mosseae对油茶根系的侵染率呈现先增加、后降低的趋势，在3.75 mmol/L NH4NO3浓度下最高，分别为41.74%±6.77%和38.34%±7.39%，在15.00 mmol/L NH4NO3浓度下最低，分别为23.67%±3.25%和24.19%±3.46%。

图1 不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗的AM真菌侵染率Fig. 1 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the infection rate of AM fungi in C. oleifera

不同接种AM真菌及施氮处理下油茶的株高和地径如图2所示。由图2中的双因素方差分析结果可知：接种AM真菌和施氮处理对油茶幼苗株高和地径的影响显著（P＜0.05）；两者的交互作用对地径的影响显著（P＜0.05），对株高的影响不显著（P＞0.05）。随着氮浓度的增加，接种和未接种油茶幼苗的株高呈现先上升、后下降的趋势，于3.75 mmol/L NH4NO3浓度下达到峰值；而油茶幼苗的地径随着氮浓度的增加呈现上升的趋势。在不施氮条件下，接种C.etunicatum使油茶幼苗株高提高了14.88%，接种F.mosseae使油茶幼苗株高提高了3.88%，接种C.etunicatum的油茶株高显著高于接种F.mosseae的处理（P＜0.05）。在 3.75、7.50和 15.00 mmol/L NH4NO3浓度下，接种F.mosseae使油茶株高提高的幅度（12.68%、12.04%和12.93%）大于接种C.etunicatum的提高 幅 度（10.55%、0.73%和10.22%）。 在0和3.75 mmol/L NH4NO3浓度下，接种C.etunicatum显著增加了油茶幼苗的地径（23.35%和13.23%）（P＜0.05）。在0、3.75和7.50 mmol/L NH4NO3浓度下，接种F.mosseae显著增加了油茶幼苗的地径（16.92%、16.68%和11.73%）（P＜0.05）。

图2 不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗的株高和地径Fig. 2 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the height and stem diameter of C. oleifera

2.2 接种AM真菌及施氮对油茶根系形态的影响

不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗根系的各形态指标见表1。由表1中双因素方差分析结果可知：接种AM真菌及施氮对油茶根系的长度、平均直径、体积和表面积有显著影响（P＜0.05）；两者的交互作用对根系的表面积、体积和平均直径有显著影响（P＜0.05），对根系长度无显著影响（P＞0.05）。随着氮浓度的增加，接种和未接种油茶根系的长度、平均直径、体积、表面积均呈现先增、后降的趋势，根系的长度、体积和表面积在3.75 mmol/L NH4NO3浓度下达到峰值。在4种NH4NO3浓度下，与未接种和接种C.etunicatum的油茶幼苗相比，接种F. mosseae显著增加了油茶幼苗根系的长度（除0和3.75 mmol/L NH4NO3外）、体积和表面积（P＜0.05）。在0和3.75 mmol/L NH4NO3浓度下，接种F. mosseae的油茶幼苗根系的平均直径显著高于未接种植株（P＜0.05）。

2.3 接种AM真菌及施氮对油茶气体交换参数的影响

不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗叶片的气体交换参数如图3所示。由图3中的双因素方差分析结果可知，接种AM真菌处理和施氮处理对净光合速率、胞间CO2浓度、蒸腾速率和气孔导度有显著影响（P＜0.05）；两者的交互作用对胞间CO2浓度有显著影响（P＜0.05），对净光合速率、蒸腾速率和气孔导度的影响不显著（P＞0.05）。随着氮浓度的增加，油茶净光合速率呈先升高、后逐渐稳定的趋势。在0、3.75和15.00 mmol/L NH4NO3浓度下，接种F.

mosseae使油茶净光合速率提高的量显著高于接种C.etunicatum（P＜0.05）。在4个氮浓度下，接种F.mosseae显著提高了油茶的净光合速率（20.00%、28.01%、17.52%、22.04%）、胞间CO2浓度（4.59%、11.74%、1.72%、5.90%）和蒸腾速率（25.95%、38.73%、22.74%、28.95%）。

表1 不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗根系的各形态指标†Table 1 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the root morphological index of C. oleifera

图3 不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗叶片的气体交换参数Fig. 3 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the gas exchange parameters of C. oleifera

2.4 接种AM真菌及施氮对油茶叶绿素荧光参数的影响

不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗叶片的叶绿素荧光参数如图4所示。由图4中的双因素方差分析结果可知，接种处理对油茶叶片的最大光化学效率、实际光化学效率、光化学猝灭和非光化学猝灭有显著的影响（P＜0.05），施氮处理对油茶最大光化学效率、实际光化学效率和光化学猝灭有显著影响（P＜0.05）；两者交互作用对油茶最大光化学效率、实际光化学效率、光化学猝灭和非光化学猝灭有显著影响（P＜0.05）。随着氮浓度的增加，接种与未接种油茶最大光化学效率、实际光化学效率、光化学猝灭和非光化学猝灭均呈现先上升、后下降的趋势（图4）。在4个氮浓度下，接种F.mosseae显著提高了油茶的最大光化学效率（16.23%、26.63%、16.92%、33.18%）、实际光化学效率（37.61%、32.27%、33.10%、29.38%）、光化学猝灭（13.88%、8.89%、3.97%、4.74%）和非光化学猝灭（16.94%、24.07%、17.60%，除15 mmol/L NH4NO3外）；接种C.etunicatum显著提高了油茶最大光化学效率（11.01%、11.13%、9.96%、20.77%）和实际光化学效率（33.10%、25.01%、32.51%、28.96%）。在4个氮浓度下，接种F.mosseae后油茶最大光化学效率的增量显著高于接种C.etunicatum（P＜0.05）。在0和3.75 mmol/L NH4NO3浓度下，接种F.mosseae后油茶实际光化学效率的增量显著高于接种C.etunicatum（P＜0.05）。

图4 不同接种AM真菌及施氮处理下油茶幼苗叶片的叶绿素荧光参数Fig. 4 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on chlorophyll fluorescence parameters of C. oleifera

2.5 油茶幼苗生长、根系形态和光合特性的综合评价

为筛选适宜油茶生长的最佳氮水平和AM真菌，采用PCA分析方法对不同氮素水平和AM真菌处理下油茶的根系形态、光合特性和生长情况进行综合评价。将株高、地径、根系长度、根系平均直径、根系体积、根系表面积、净光合速率、胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导度、最大光化学效率、实际光化学效率、光化学猝灭和非光化学猝灭这14个指标作为原始指标，将数据标准化后进行PCA分析。根据特征值、方差贡献率和累计方差贡献率将原始指标分成14个主成分，前2个主成分的累计方差贡献率达84.56%，说明这2个主成分可以反映出原始指标的大部分信息（表2）。

表2 油茶幼苗的生长、根系形态和光合特性指标的主成分分析结果Table 2 Principal component analysis of C. oleifera seedlings growth, root morphology and photosynthesis characters

由表2可知，根系长度、根系表面积、净光合速率和最大光化学效率的载荷值均大于0.9，对第1主成分起主要作用，第2主成分中载荷值最大的为株高。根据2个主成分的特征值和因子载荷，得出各主分分值计算公式：

式中：Y1和Y2分别表示第1主成分和第2主成分的得分；X1～X14分别表示株高、地径、根系长度、根系平均直径、根系体积、根系表面积、净光合速率、胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导度、最大光化学效率、实际光化学效率、光化学猝灭和非光化学猝灭的标准化后的特定值。

经计算可得主成分综合得分及排序（表3），结果表明无论是否接种AM真菌，各施氮处理按油茶苗的综合得分从高到低排序依次均为3.75、7.50、15.00、0 mmol/L NH4NO3；同一氮水平下，各接种处理按油茶苗的综合得分从高到低排序依次为接种F.mosseae、接种C.etunicatum、不接种处理。因此，3.75 mmol/L NH4NO3和F.mosseae分别是增强油茶的光合作用和促进其生长效果最佳的氮水平和AM真菌。

表3 接种AM真菌及施氮处理的主成分得分及排序Table 3 Principal component score and ranking of AM inoculation and nitrogen treatments

3 结论与讨论

综上所述，F.mosseae和C.etunicatum均能与油茶形成良好的共生关系，改善根系形态，增强光合作用，促进其生长。相较于C.etunicatum，接种F.mosseae提高油茶的株高和地径、改善根系形态、增强光合作用的效果更佳。在4种氮浓度水平（0、3.75、7.50、15.00 mmol/L NH4NO3）中，3.75 mmol/L NH4NO3是促进油茶生长的最适氮水平。

AM真菌是一类专性活体营养共生微生物，对宿主植物根系的侵染是其功能发挥的前提。土壤中的氮含量影响AM真菌对根系的侵染率[17]，Calabrese等[18]经研究发现高氮条件下AM真菌对毛果杨Populus trichocarpa的侵染率比低氮条件下更高，而Pan等[19]经研究发现高氮降低了AM真菌对大籽蒿Artemisia sieversiana和羊草Leymus chinensis的侵染率。本研究结果表明，随着施氮浓度的增加，AM真菌对油茶根系的侵染率先增加、后降低。这可能是因为不施氮条件下，土壤中养分匮乏限制了AM真菌的菌丝生长和孢子发育，随着土壤中可利用的矿质营养增多，宿主植物对AM真菌的依赖性可能会降低，并且光合产物向AM真菌的分配减少[20]，从而导致AM真菌对油茶的侵染率下降。

根系是植物吸收水和矿质养分的主要器官，根系形态影响植物根系对水分和矿质养分的吸收。本研究结果表明，随着氮浓度的增加，油茶幼苗根系长度、体积和表面积呈先增加、后降低的趋势，在3.75 mmol/L NH4NO3浓度下达到峰值。该结果与王树起等[21]得出的研究结果一致，这可能是因为适宜水平的氮能促进根系生长，而高氮条件下土壤中硝酸盐含量过高，抑制植物生长素的生物合成，或限制生长素从枝向根的转移，从而抑制根的生长[22]。大量研究结果表明，菌根化植物的根系长度、根系表面积和根系体积等均显著高于未菌根化植物[23-24]。前期研究结果表明，接种C.etunicatum显著增加了油茶根系的长度、体积、投影面积等[14]。本研究结果进一步证实：接种F.mosseae和C.etunicatum均能促进油茶根系的生长，且接种F.mosseae比接种C.etunicatum对油茶根系生长的促进效果更好。

光合作用为油茶生长发育提供物质基础，直接影响油茶的品质和产量[13]。氮是叶绿素的重要组成成分，施氮对植物的叶绿素荧光特性及光合作用有明显的调节作用[25]。袁德梽[26]的研究结果表明，随着施氮水平的提高，油茶光合特性变化由强到弱依次为中氮（40 g/m）、高氮（50 g/m）、低氮（20 g/m）。本研究结果表明，随氮浓度的升高，油茶最大光化学效率、实际光化学效率和株高呈先升高、后降低的趋势，其中3.75 mmol/L NH4NO3是改善油茶光系统Ⅱ性能和促进生长的最佳氮水平。接种AM真菌能有效提高许多木本植物的光合速率，促进植物生物量的积累和植株的生长发育[27]。本研究结果表明，接种2种AM真菌均显著改善了油茶的气体交换参数和叶绿素荧光参数，提高了油茶的株高和地径，该结果与黄京华等[28]、林宇岚等[29]、欧静等[27]的研究结果一致。这可能是因为接种AM真菌可以提高宿主植物的叶绿素含量，有利于其捕捉光能，从而改善了油茶的光合特性和生长状况[30]。

AM真菌对宿主植物的影响存在种间差异[28]。韦正鑫等[13]研究了28种AM真菌对滇重楼光合特性和生长的影响，发现5种AM真菌对滇重楼的促生效果好于其他23种。黄京华等[28]发现F.mosseae对黄花蒿营养吸收的促进作用高于变形球囊霉Glomus versiforme。本研究结果表明：不施氮条件下，接种C.etunicatum的油茶株高显著高于接种F.mosseae的植株；施氮后，接种F.mosseae的油茶株高、最大光化学效率、实际光化学效率、根系长度、根系体积、根系表面积的增量高于接种C.etunicatum的植株。主成分分析结果表明，在相同氮水平下，接种F.mosseae处理的排序均优于接种C.etunicatum处理，因此接种F.mosseae比接种C.etunicatum更适用于促进油茶幼苗的生长。

本试验中从油茶生长、根系形态和光合特性的角度探究了适合油茶生长的最适氮浓度和AM真菌，但尚不明确AM真菌促进油茶吸收和利用氮素的机制，在后续的研究中，将围绕AM真菌对油茶吸收和转运氮素的影响进行研究，探究AM真菌参与调控油茶氮营养的生理机制和分子机制。