全外显子测序在Waardenburg综合征的应用

吴晓丽 吴蓓 严树涓 姜敏敏 马星卫

(贵州省人民医院产前诊断中心，贵州 贵阳 550002)

Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome)是一种罕见的遗传性疾病，临床表现为听力正常、单侧或双侧中度至极重度听力损失，听力损失多是先天性的；头发、皮肤和虹膜色素沉着，比如白发或头发过早变灰，白点病，雀斑[1]。Waardenburg 综合征的临床表型多样，即使在同一家庭的不同个体之间，携带相同基因突变，也会因临床外显率不同或其他原因，使得个体有较大差异[2]。本文报道1例通过全外显子测序方法，所检测到MITF基因突变所导致的Waardenburg综合征，对患者及家系成员提供基因诊断及遗传咨询。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者，男性，26岁，因“听力障碍”就诊于我院遗传咨询门诊。患者从小双耳听力微弱，随着年龄增长，听力越来越弱；目前存在听力障碍，但未完全丧失听力。否认幼儿时期有发烧等。核心家系调查，绘制家系图谱，患者及家属均签署知情同意书，进行遗传病全外显子测序检测。

1.2方法 留取患者、其父母及姐姐静脉血各2 mL，EDTA抗凝。使用德国Qiagen DNA提取试剂盒提取患者及其家系成员的外周血DNA，按照说明书进行DNA提取和保存。首先从受检者提供的检测样本中提取基因组DNA并随机打断，然后对外显子区域进行序列捕获，最后采用Illumina Hiseq测序仪进行高深度测序。数据分析在基因数据分析解读平台Seqmax上完成，总共包括五个步骤：(1)去除低质量reads和接头序列；(2)将reads比对到参考基因组；(3)变异检测；(4)变异过滤和注释；(5)筛选和患者临床表型相关的基因和变异。变异注释包含有千人基因组、ExAC、gnomAD、OMIM、ClinVar和HGMD专业版等数据库相关内容。变异的致病性分级主要基于致病变异数据库和ACMG指南。由NCBI网站下载MITF基因DNA全序列，采用Primer5软件设计聚合酶链式反应引物。引物序列：正向CTATGCCCAAACCAACTGCT；反向ATGGCAATGTTCCTAGCTTTCTC，PCR产物大小456 bp。PCR反应条件：94℃预热4 min，共35个循环：94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，最终扩增延长72℃ 7 min，4℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后纯化，进行双向测序。

2 结 果

患者，男性，26岁，从小双耳听力微弱，随着长大，听力越来越弱；目前存在听力障碍，但未完全丧失听力。外观可见双眼瞳孔呈蓝色(图1)，无视力异常。针对耳聋易感基因SLC26A4、GJB2、GJB3、mtDNA基因测序检测，均未见突变。患者爷爷存在听力障碍(已故)；父母无听力异常；姐姐左耳听力减弱，右耳听力正常。详见家系图谱(图2)。经全外显子测序，MITF基因在chr3:69988315(HG19)存在c.328C>T(p.Arg110Ter)杂合突变。ACMG变异分类：I类致病。相关疾病：Warrdenburg综合征II型。进一步使用Sanger测序，患者及家系结果如图2所示。

图1 患者眼睛照片

注：Ⅰ1.患者父亲，携带致病突变；Ⅱ2.患者母亲，未携带致病突变；Ⅱ1.患者姐姐携带致病突变，左耳听力减弱，右耳听力正常；Ⅱ2.患者本人，携带致病突变，双耳听力障碍，虹膜蓝色。

3 讨 论

Warrdenburg综合征是一种定义明确、但遗传异质性的疾病。MITF基因突变在Warrdenburg综合征中引起相关症状的比率大约占27.6%，仅低于PAX3基因突变所占比率48.4%，排名第二位；而在Warrdenburg综合征II型中与MITF基因突变相关所占比率大约为84.6%；MITF基因突变在Warrdenburg综合征中约90%患者有听力损失，其中重度至极重度听力障碍所占比率超过60%，严重程度远超过PAX3基因突变所致听力损失[3]。在本研究中，对患者(先证者)通过全外显子测序手段，检测到MITF基因的 c.328C>T杂合突变，再进一步对其父母及姐姐进行该位点的家系检测，患者父亲及姐姐携带该基因位点突变。该变异所在区域是这个蛋白质的重要组成部分，不同物种的氨基酸序列高度保守。通过动物实验等研究[4-5]，很大可能是因为MITF基因突变丧失功能所引起的单倍剂量不足，导致相关症状出现。

在S.Yang等[6]研究中，在同一家系13人检测到该突变，但此13人无论在虹膜颜色、皮肤情况、头发变白、还是听力损失等各个方面，表现都各不相同，从完全无相关症状到极重度耳聋。本研究中，患者表现为中-重度的听力损失，伴随虹膜颜色呈蓝色，有着与Waardenburg综合征II型明确相关的临床表型；但患者姐姐并无虹膜颜色改变，且仅一侧听力减弱，另一耳听力正常；该患者父亲，并无Waardenburg综合征II型的相关症状。与S.Yang等的研究结论一样，再次验证了Waardenburg综合征II型在临床外显率差异明显，有不完全外显特征。