冠突散囊菌LJSC.2005对茯茶主体黑毛茶发花品质影响

汤依钰，俞梦瑶，禹利君,2,3,4*，黄建安,2,3,4，王坤波,2,3,4，刘仲华,2,3,4*

1. 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3. 植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙 410128；4. 农业农村部园艺作物基因资源评价利用重点实验室，湖南 长沙 410128

茯茶是黑茶中深受消费者喜爱的茶类，主产于湖南安化，以槠叶齐、云台大叶、桃源大叶等品种制成的黑毛茶作为主要加工原料，具有独特的风味。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）在茯茶发花过程中的酶促氧化作用，是形成茯茶独特的滋味成分及菌花香特征的关键[1]。研究发现，茯茶具有降脂减肥[2]、抗癌细胞增殖[3]、抗菌消炎[4]、改善吸烟造成的肺损伤[5]等诸多功效。发花散茶兼顾传统茯茶功效的同时，还具有冲泡方便、“金花”（冠突散囊菌孢子囊）茂盛、菌香明显等特点。通过使用冠突散囊菌单一菌种进行散茶发花，得到的发花散茶品质稳定、安全。

香气是茶叶品质判别的重要指标。气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）精确性好、灵敏度高，已成为分析茶叶香气品质的重要方法。Shi等[6]运用 GC-MS检测到茯砖茶的主要香气成分包括酮类、醛类、酯类等。顶空固相微萃取法（HS-SPME）作为茶叶香气收集的方法之一，可以有效防止检测过程中香气成分的降解、氧化及组分间二次反应[7]，是 GC-MS前处理的优选方法。茯茶发花期间香气组成变化已有一些研究报道[8-10]，但研究选择的多为传统工艺发花的茯砖茶成品，发花环境因素复杂。本研究收集了湖南具有代表性的黑毛茶，并对其工艺特点进行总结考究，通过提取纯化的冠突散囊菌LJSC.2005（GenBank accession numbers: MZ147024）进行散茶发花，将发花前后的茶样进行感官审评、茶叶生化成分检测和 HP-SPME/GC-MS香气分析，探究冠突散囊菌 LJSC.2005参与不同湖南茯茶主体黑毛茶发花前后的滋味品质及香气成分变化，为湖南茯茶品质提升提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

黑毛茶由湖南代表性茶厂提供（编号1、3、5、7、9、11），其对应发花散茶（编号2、4、6、8、10、12）参考 Xu等[11]方法，以冠突散囊菌LJSC.2005为单一菌种发花所得，试验在湖南农业大学茶学教育部重点实验室完成。部分毛茶经历了七星灶熏烟、去梗工序，具体信息详见表1。

表1 茶样信息Table 1 The information of tea samples

1.2 试验仪器

UV-1750型紫外可见分光光度计、LC-M20A型分析型高效液相色谱、GC/MS-QP2010型气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司；手动SPME进样器、PDMS/DVB固相微萃取头，美国Supelco公司。

1.3 试验试剂

甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级）购自美国TEDIA公司；没食子酸、茶碱、可可碱和儿茶素标准品购自美国Sigma有限公司；槲皮素、杨梅素和山奈酚标准品（纯度≥98%）购自成都曼斯特生物科技有限公司；碳酸钠、福林酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、茚三酮、氯化铝、蒽酮、浓硫酸均为国产分析纯。

1.4 感官审评

参考 GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中黑茶散茶的审评方法，将12个茶样分为黑毛茶和发花散茶2组进行密码审评。审评小组由具有长期茶叶审评经验的 3名教授及2名硕士研究生组成。按照外形、汤色、香气、滋味、叶底的顺序，逐项对茶样进行百分制审评打分，并对结果进行加权计算得到总分。

1.5 生化成分检测

茶多酚含量测定采用福林酚比色法，参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；水浸出物含量测定参照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》；游离氨基酸含量测定采用茚三酮比色法，参照GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》；黄酮类化合物总量的测定采用三氯化铝比色法，可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法。

儿茶素、生物碱检测方法参照Samanidou等[12]方法，试液制备浸提方法参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，浸提液经 0.45 μm 纤维膜过滤。色谱柱为 Welchrom C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流动相A为0.2%磷酸，流动相B为V甲醇∶V乙腈=95∶5，梯度洗脱，流速0.8 mL·min-1，柱温30℃，进样量10 μL，检测波长278 nm。

黄酮醇类物质检测参照刘雁等[13]方法，试液制备参考张纪伟等[14]方法，色谱柱为Welchrom C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流动相A为0.2%磷酸，流动相B为100%甲醇，梯度洗脱，流速1 mL·min-1，柱温30℃，进样量10 μL，检测波长为360 nm。

1.6 GC-MS检测分析

称取2.0 g磨碎茶样于20 mL萃取瓶，80℃水浴平衡 10 min，萃取头 210℃老化 50 min，吸附50 min，250℃解吸附5 min。

GC条件：HP-88石英毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm），进样口温度 240℃，流速1.37 mL·min-1。升温程序：初始温度60℃保持5 min；以3℃·min-1升至140℃，保持5 min；以 5℃·min-1升至 210℃，保持 10 min；以5℃·min-1升至 240℃，保持 10 min。进样方式为不分流进样，载气为He。

MS条件：离子源（EI），离子源温度200℃，转接口温度220℃，电子能量70 eV，质量扫描范围为45～500m/z。

1.7 数据整理

采用 SIMCA-P 14.1软件、IBM SPSS Statistics 19软件、WPS 2019教育版、联川生物云平台（www.omicstudio.cn/tool）进行数据统计和图表制作。根据GC-MS分析得到各色谱峰的质谱信息，参考NIST17标准谱库，结合文献筛选相似度大于 80%的挥发性成分进行定性分析；根据香气成分的峰面积采用峰面积归一法得到各个香气成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 黑毛茶及发花散茶感官审评结果分析

发花前后茶样感官品质有明显改变（表2）。发花后，干茶色泽加深，茶条平伏卷紧，金花满披、颗粒颜色亮黄，油润发亮有光泽；气味纯正无异味，香气更加浓郁，菌花香显露；茶汤清澈明亮，颜色变红、加深；滋味更加醇和厚重；叶底颜色加深，叶片、嫩梗变软。冠突散囊菌 LJSC.2005发花能够明显降低黑毛茶过重烟熏味，减轻茶样青气及涩味，使得茶样茶香、菌香、松烟香调和，整体评分上升。黑毛茶初制工艺影响冠突散囊菌 LJSC.2005发花品质，主要表现在缺少烟熏且同时伴有剔梗的桃源大叶A发花过度、略带酸味。

表2 黑毛茶及发花散茶感官审评结果Table 2Sensory evaluation results of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatumLJSC.2005

2.2 黑毛茶及发花散茶生化成分分析

主要内含成分检测结果表明（表3），黑毛茶经冠突散囊菌LJSC.2005发花后，发花散茶中黄酮类、茶多酚和游离氨基酸含量下降，水浸出物和可溶性糖含量总体呈下降趋势。黄酮类、茶多酚和游离氨基酸含量降幅最大的茶样分别为云台大叶B、槠叶齐B和云台大叶B，分别为33.87%、39.62%和47.74%。安化云台山八角茶叶有限公司和湖南省云上茶业有限公司朱冲茶厂的黑毛茶经发花后水浸出物含量有所下降，其中云台大叶 A降幅最大，为9.69%，其余茶样则有不同幅度的上升，其中槠叶齐B增幅最大，达9.71%。可溶性糖含量结果显示，仅有湖南省白沙溪茶厂股份有限公司的黑毛茶发花后有所上升，其中槠叶齐 B增幅较大，达 42.38%，而其余黑毛茶茶样发花后可溶性糖含量下降，桃源大叶 A降幅达28.42%。

表3 黑毛茶及发花散茶主要内含成分含量Table 3The main contents of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatum LJSC.2005%

HPLC对儿茶素、生物碱和黄酮醇类物质的生化检测结果显示（表4），黑毛茶经冠突散囊菌LJSC.2005发花后，发花散茶没食子酸和咖啡碱呈上升趋势，可可碱变化不明显，儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚呈下降趋势。没食子酸仅有槠叶齐 B发花后含量下降，降幅19.07%，云台大叶B发花后没食子酸含量增幅最大，达440.46%。可可碱含量结果中，安化云台山八角茶叶有限公司和湖南省云上茶业有限公司朱冲茶厂的黑毛茶发花后含量下降，其中云台大叶A降幅最大，达60.00%，其余茶样中桃源大叶A可可碱含量增幅最大，为19.57%。云台大叶品种发花后咖啡碱含量下降，其中云台大叶A降幅较大，为16.10%；桃源大叶B发花后咖啡碱含量增幅最大，为16.86%。各茶样中的儿茶素含量在发花后基本呈下降趋势，EG和DL-C含量降幅最大的分别为云台大叶A（50.75%）和云台大叶B（34.23%）；EGCG、EC、GCG、ECG含量降幅最大的均为槠叶齐A，分别为 96.46%、53.70%、92.46%、96.14%；槠叶齐A、云台大叶A和桃源大叶B发花后DL-C含量上升，云台大叶A增幅最大（262.10%）。各茶样中杨梅素、槲皮素和山奈酚含量在发花后大多呈下降趋势，降幅最大的分别为云台大叶B（64.55%）、云台大叶B（64.52%）、桃源大叶B（25.83%）。

表4 黑毛茶及发花散茶生化成分含量Table 4Biochemical component contents of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatum LJSC.2005 mg·g-1

2.3 黑毛茶及发花散茶香气组成和相对成分分析

所有茶样共检测到71种香气成分（表5），其中碳氢化合物14种，醇类16种，醛类10种，酯类6种，酚类4种，内酯类1种，含氮化合物6种，含氧化合物4种，含量较多的为碳氢化合物（22.85%）、醇类（20.78%）、酮类（12.49%）、醛类（12.49%）。在黑毛茶中检测到香气成分 55种，特有香气成分 8种；在发花散茶中检测到香气成分63种，特有香气成分16种，两者共有香气成分47种（图1-A）。12个茶样都含有的香气成分共 12种（图1-C），除了槠叶齐B之外，所有茶样发花后香气成分种类增多（图1-B）。苯乙烯和异丁酸叶醇酯为黑毛茶共有香气成分；(E)-芳樟醇3,7-氧化物、异植物醇和苯乙酮为发花散茶共有香气成分（图1）。黑毛茶经冠突散囊菌LJSC.2005发花后，所有茶样醛类和酯类香气成分含量上升，安化云台山八角茶叶有限公司和湖南省云上茶业有限公司朱冲茶厂的茶样出现含氧化合物，其他种类香气成分基本呈下降趋势（图2）。

表5 黑毛茶及发花散茶主要香气成分和相对含量Table 5 Main aroma components and their relative contents in the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005%

续表5

图1 黑毛茶及发花散茶共有及特有香气成分数量Fig. 1 Quantity of common and unique aroma components of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

图2 黑毛茶及发花散茶香气成分组成Fig. 2 Composition of aroma components of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

2.4 黑毛茶及发花散茶特征香气成分分析

在SIMCA软件中对茶样香气成分相对含量进行主成分分析（PCA），所构成的模型中R2X=0.451，Q2=0.126，模型质量较好，分析结果所作Biplot图中（图3-A），同一坐标轴上同方向的样品和香气成分呈正相关。PCA结果表明，发花前后茶样区别明显且发花后香气近似。根据是否发花将所有茶样分为黑毛茶和发花散茶两组，构建OPLS-DA模型进行两两比较，拟合参数R2X=0.496，R2Y=0.99，Q2=0.931，说明该模型具有较好区分能力和预测能力，并作Biplot图（图3-B）、permutation图（图3-C）（n=200）和S-plot图（图3-D）。VIP predictive共筛选出 20种差异香气成分（VIP值≥1），t检测（Students’t-test）中P值≥0.05的香气成分共4种，分别为(E,E)-2,4-

庚二烯醛、正十二烷、雪松醇、香叶基丙酮；P值≤0.05的香气成分共16种，分别为水杨酸甲酯、(E)-氧化芳樟醇（呋喃类）、正十三烷、(E)-芳樟醇3,7-氧化物、苯甲醇、苯乙醇、苯乙烯、橙花醇、(E)-2-已烯醛、(E)-橙花叔醇、正十四烷、苯乙酮、(E)-2-辛烯醛、β-紫罗兰酮、异丁酸叶醇酯、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮，为检测得到的湖南黑毛茶经冠突散囊菌LJSC.2005发花前后差异性香气成分。

图3 黑毛茶及发花散茶香气成分SIMCA分析结果Fig. 3 SIMCA analysis of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

3 讨论与结论

结合感官审评与生化成分检测结果发现，采用冠突散囊菌 LJSC.2005对湖南茯茶主体黑毛茶进行发花后，发花散茶的茶汤呈现出更加醇和的口感，黄酮类、茶多酚和游离氨基酸呈下降趋势，特别是酯型儿茶素中的 EGCG降幅显著，可能是茶汤苦涩味消失的主要原因。发花散茶可溶性糖含量变化中，仅湖南省白沙溪茶厂股份有限公司茶样的含量上升；水浸出物含量变化中，仅桃源县君和野茶开发有限公司与湖南省白沙溪茶厂股份有限公司茶样的含量有所上升，与传统茯砖茶发花变化存在差异[15]。大部分茶样发花后没食子酸含量上升，儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚等黄酮类化合物呈下降趋。茶叶中的可可碱和咖啡碱，性质稳定、微生物利用度低，在茯茶加工过程中一般呈缓慢下降趋势[15]，但本研究中，部分茶样发花后可可碱和咖啡碱含量有所上升，推测是品种和工艺多因素导致的结果。

碳氢化合物中对茯砖茶香气有较大贡献的一般为烯烃类[9]，如差异性成分苯乙烯具轻微甜味。本研究发现，黑毛茶发花后，醇类中具有花香和木香的(E)-氧化芳樟醇（呋喃类）相对含量上升，可能源于真菌对芳樟醇的转化[16]，(E)-芳樟醇 3,7-氧化物为醇类香气物质前体，最早在乌龙茶中[17]被提取得到；苯甲醇和苯乙醇分别具有果香和甜花香，发花后相对含量下降；具有花果香和木香的橙花醇和(E)-橙花叔醇等萜醇类化合物发花后也有不同程度的下降，与传统茯砖茶发花过程中物质的变化趋势相同[18]。酮类中的β-紫罗兰酮具有紫罗兰香，为茯砖茶菌花香重要贡献物质，6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮略带刺激性肉桂香，两者在发花后含量皆下降；苯乙酮具有花香，与“菌花香”“薄荷”等气味正相关，在发花后含量上升，以上结果与Li等[18]研究结果相似。醛类中，(E)-2-已烯醛和(E)-2-辛烯醛具有青气味，发花后相对含量有所增加，其主要源于脂肪酸转化，在茯砖茶中含量明显高于普洱茶[10]。酯类中，水杨酸甲酯增幅显著，呈现冬青油草药香，同样为茯砖茶高于普洱茶的特征香气成分[19]；异丁酸叶醇酯具有花果香，发花后完全消失。内酯类化合物中，二氢猕猴桃内酯具有香豆素和麝香味，发花后相对含量减少，趋势与传统茯砖茶发花过程一致[18]。

本研究发现，采用冠突散囊菌LJSC.2005对湖南茯茶主体黑毛茶进行发花能够很好地促进茶叶品质转化。感官审评结果显示，发花能够削弱工艺与品种对茶样感官品质的影响，使茶样获得浓郁纯正的菌花香味和醇厚口感。生化成分检测结果表明，茯茶发花过程中水浸出物含量、可溶性糖含量变化趋势与工艺相关，可可碱和咖啡碱含量变化趋势可能与品种相关，其余物质基本呈下降趋势。香气检测结果表明，黑毛茶发花后香气种类数目增多，种类变化与传统茯砖茶发花过程基本一致[18]。香气成分中含量最多的为碳氢化合物，与Zheng等[20]研究结果不一致，可能是因为茯茶加工工艺和发花过程中涉及到的微生物种类及优势菌种不同所致。本研究收集的云台大叶、槠叶齐和桃源大叶3个茶树品种在湖南省种植面积广，均选育自安化群体品种，亲缘关系较近；研究发现黑毛茶的初制工艺对于冠突散囊菌 LJSC.2005发花过程中生化成分的变化影响明显。后期研究可选择特异性较强或亲缘关系较远的茶树品种制作黑毛茶，以冠突散囊菌LJSC.2005进行散茶发花，研究品种、工艺对于茯茶品质的影响，分析其滋味香气变化，探究原料品种、制作工艺及金花菌种多因素对湖南茯茶品质的影响，以期进一步提升湖南茯茶品质。