塞拉菌素促进人结肠癌细胞自噬体积累抑制其增殖的研究*

潘 江，乔 坤，程 琳

成都医学院 生物科学与技术学院（成都 610500）

结肠癌是全世界较常见的恶性肿瘤之一，在所有癌症中，其发病率排名第3，病死率排名第2[1]。目前，化疗仍是临床治疗结肠癌的主要方法，但依然存在化疗效果不佳的问题，其主要原因在于化疗药物不良反应大且容易产生耐药性[2]，因此迫切需要寻找新的治疗结肠癌的药物。新的靶向药物的开发是一个漫长的过程，其成本高、成功率低[3]。开发已上市药物新的适应症，已成为加快抗肿瘤药物发展的新方向，对优化肿瘤治疗方案具有重要意义。

研究[4-5]发现，阿奇霉素、阿维菌素、克拉霉素、伊维菌素等对肿瘤有良好的抗癌活性。伊维菌素通过促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的线粒体凋亡途径和诱导结肠癌细胞的S期停滞来抑制细胞增殖，且在体外和体内抑制乳腺癌细胞生长和诱导胶质母细胞瘤细胞死亡[6]。塞拉菌素（Selamectin，Sela）是大环内酯类抗生素的家族成员之一，结构与伊维菌素类似，目前被广泛用于治疗河盲症和其他寄生虫感染[7]。有研究[8]显示，Sela通过抑制乳腺癌的克隆性自我更新来抑制生长和转移，通过上调钙粘蛋白1（CDH1）和雌激素受体1（ESR1）的表达来抑制乳腺癌的侵袭。也有研究[9-10]表明，Sela能抑制鼻咽癌细胞生长，调控结肠癌细胞Wnt信号通路，提示Sela有望成为一种新的抗肿瘤药物。

自噬是一种以形成双膜自噬体为特征的自降解过程，它隔离多余或有缺陷的细胞器，并与溶酶体融合后降解封闭的物质，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[11]。过度的自噬或其水平的降低都会影响细胞的增殖、生存、分化等[12]。在结肠癌中，可以清楚地观察到自噬的双重作用，所以促进肿瘤细胞自噬也是一种有希望的结肠癌治疗策略[13]。本研究初步探讨Sela对SW480细胞自噬的影响，研究其潜在的作用机制，以期为Sela治疗结肠癌提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株及质粒

人结直肠癌细胞SW480和正常结肠上皮细胞NCM460购自成都飞欧尔生物科技有限公司；pEGFP-LC3及pmCherry-EGFP-LC3质粒购自上海艾博思生物科技有限公司。

1.2 药品与试剂

RPMI1640培养基（货号：01-100-1A）、胎牛血清（货号：04-010-1A）购自以色列Biological Industries公司；Sela（批号：210404，纯度＞97%）购自济南凯恩医药科技有限公司；凋亡抑制剂Z-VAD-FMK（货号：HY-16658B）、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（货号：HY-100579）、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1（货号：HY-15760）购自美国MedChemExpress公司；渥曼青霉素（Wortmannin，货号：S2758）、羟氯喹 （HCQ，货号：S4430）购自美国Selleckchem公司；LipofectamineTM3000转染试剂（货号：L3000015）购自美国Invitrogen公司；LC3（货号：14600-1-AP）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）（货号：66888-1-Ig）、PhosphomTOR（货号：67778-1-Ig）、p70S6K（货号：66638-1-Ig）购自武汉三鹰生物技术有限公司；p62（货号：380612）、GAPDH抗体（货号：200306-7E4）购自成都正能生物有限责任公司；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）（4685）、Phospho-Akt（Ser473）（货号：4060）、Phospho-p70S6K（Thr389）（货号：9205）抗体购自美国CST公司；ECL化学发光试剂盒（货号：180-5001）购自上海天能科技有限公司；考马斯亮蓝G250染液（货号：1610786）购自上海Bio-Rad公司；质粒小提试剂盒（货号：DP104）购自北京天根生物科技有限公司。

1.3 仪器

细胞培养箱、生物安全柜、高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；酶标仪测定仪（Molecular Devices公司，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；电子分析天平（梅特勒-特利多仪器有限公司，美国）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；垂直电泳系统（Bio-Rad公司，美国）；化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 所有细胞都使用RPMI1640培养基（含有10%胎牛血清），于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每隔2～3 d进行传代。

1.4.2 细胞活力测定 将处于对数期的细胞按5 000个/孔接种于96孔板中并培养过夜，加入100 μL指定浓度的药物培养24 h进行MTT实验。培养完成后，在每个孔中加入10 μL 5 g/L MTT并孵化4 h。移除培养基，并向每个孔中加入150 μL DMSO，置于摇床上震荡10 min。采用酶标仪在490 nm处测量吸光度A值，计算细胞活力。细胞活力（%）=（加药组A值-阴性对照A值）/（空白组A值-阴性对照A值）×100%。

1.4.3 克隆形成实验 接种于6孔板（300 个/孔）的各组细胞培养过夜，用指定浓度的Sela连续培养细胞7～10 d。菌落用4%的多聚甲醛固定并结晶紫染色，用显微镜进行细胞计数。

1.4.4 蛋白质印迹技术 细胞给药24 h后，PBS洗两次，加入RIPA缓冲液裂解1 h后离心提取总蛋白，采用Bradford对蛋白质进行定量。每个样品取约40 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、封闭，在4 ℃冰箱过夜孵育一抗。TBST洗膜30 min，37 ℃孵育二抗1 h，TBST洗膜5次后用ECL化学发光试剂盒进行显色。

1.4.5 pEGFP-LC3、pmCherry-EGFP-LC3质粒转染实验检测自噬体、自噬溶酶体 pEGFP-LC3质粒转染细胞表达的绿色荧光蛋白（GFP）可用于标记及追踪LC3，当自噬发生时，LC3定位到自噬小体中，因此荧光显微镜下的绿色荧光斑点指示自噬体。pmCherry-EGFP-LC3 串联荧光蛋白转染细胞表达的mCherry和GFP可用于标记及追踪 LC3。GFP绿色荧光蛋白对酸性比较敏感，当自噬小体与溶酶体发生融合，形成自噬溶酶体，GFP 荧光将发生淬灭，只能检测到红色荧光。因此，在显微镜下红色的斑点指示自噬溶酶体，而红绿荧光融合后出现的黄色斑点即指示自噬体。将细胞以10 000个/孔细胞的密度均匀接种于24孔板中，待细胞完全贴壁且密度达到50%～60%时，分别使用pEGFP-LC3及串联pmCherry-EGFP-LC3质粒，加入LipofectamineTM3000对细胞进行转染72 h。在指定浓度的Sela处理24 h后，添加4%多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS冲洗两次，并用防淬灭的固定剂封片，放到共聚焦荧光显微镜下进行观察拍照。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析，定量资料采用（）表示，两组数据间采用独立样本t检验，多组数据间采用单因素方差分析。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 Sela对结肠癌细胞SW480增殖作用的影响

MTT结果分析显示，Sela处理 24 h后，SW480细胞活力以浓度依赖的方式下降，IC50为18.3 μmol/L，而正常的结肠黏膜上皮细胞NCM460则对Sela更具耐受性，其IC50为 41.7 μmol/L（图 1A）。为了进一步证明Sela对SW480细胞增殖的长期抑制作用，克隆形成结果表明，Sela明显减少了SW480细胞的克隆生成存活率（图1B），与对照组（0 μmol/L）相比，差异有统计学意义（P＜0.001）（图 1C）。

图1 Sela对结肠癌细胞SW480的生长抑制作用

2.2 不同死亡抑制剂处理后对Sela作用下的SW480细胞活力的影响

采用Sela联合一系列死亡抑制剂处理SW480细胞，结果所示，只有HCQ（自噬体-溶酶体融合的抑制剂）和Sela的共同处理比Sela单独处理能引发更多的细胞死亡 ，差异有统计学意义（P＜0.01）；而其他抑制剂，包括Ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）、Necrostatin-1（细胞坏死抑制剂）和Z-VAD-FMK（Caspase抑制剂）不能恢复Sela诱导的细胞死亡，与Sela单独处理组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示细胞自噬可能参与了Sela诱导的SW480细胞死亡（图2）。

图2 Sela联合不同死亡抑制剂对SW480细胞活力的影响

2.3 Sela对SW480细胞自噬的影响

为了探索Sela与自噬之间的关系，用Sela处理SW480细胞，测量LC3-Ⅱ的转化率，结果显示，Sela以浓度依赖方式明显诱导LC3-Ⅱ的积累（图3A）。此外，在Sela处理的细胞中，外源性GFP-LC3斑点代表的自噬体数量也明显增加（图3B），提示Sela诱导SW480细胞发生自噬。

图3 Sela对SW480细胞自噬的影响

2.4 Sela对SW480细胞自噬流的影响

除启动自噬外，Sela诱导了SW480细胞中p62的增加，p62是自噬的底物，在溶酶体中进行降解，p62表达上调可能与自噬体周转不连续有关，表明Sela可能抑制自噬流的发生。串联的pmCherry-EGFP-LC3荧光报告实验也显示，Sela处理后导致黄色荧光自噬体明显增加，红色荧光的自噬溶酶体形成变化不明显（图4），表明Sela可能阻断了SW480细胞的自噬流。

图4 Sela对SW480细胞自噬流的影响

2.5 Sela通过促进自噬体积累对SW480细胞增殖的影响

为确定自噬在介导Sela抑制SW480细胞增殖的作用，用Sela分别与Wortmannin、HCQ联合处理SW480细胞。蛋白质印迹技术结果显示，抑制自噬启动和随后的自噬体形成的Wortmannin减少了LC3-Ⅱ的转换，明显恢复了Sela处理的SW480细胞的增殖抑制。相比之下，破坏自噬体-溶酶体融合并导致自噬体积累的HCQ，增加了LC3-Ⅱ的累积，同时MTT结果表明，HCQ明显加剧了Sela诱导的SW480细胞的增殖抑制（图5）。

图5 Sela通过自噬体积累对SW480细胞增殖的影响

2.6 Sela对SW480细胞中Akt/mTOR信号通路的影响

Akt/mTOR作为关键的负调控因子，在Akt/mTOR信号通路调控细胞自噬方面发挥着重要作用[14]。为了研究Akt/mTOR信号通路在Sela诱导SW480细胞自噬中的作用，蛋白免疫印迹检测Akt和mTOR的激活情况。与对照组0 μmol/L相比，Sela处理导致SW480细胞中p-Akt、p-mTOR以及下游p-p70S6k的表达量下调，提示在一定浓度范围内，Sela可能通过抑制SW480细胞的Akt/mTOR途径来诱导自噬（图6）。

图6 Sela对SW480细胞中Akt/mTOR信号通路的影响

3 讨论

Sela是大环内酯类抗生素的家族成员之一，主要用于抗寄生虫感染。越来越多的研究[8-10]表明，Sela在多种肿瘤中具有抗癌活性，但是其在结肠癌的具体机制尚不明确。本研究发现，Sela能抑制结肠癌细胞SW480的增殖，且具有浓度依赖性。当用不同死亡抑制剂联合处理时，铁死亡、细胞坏死及细胞凋亡抑制剂均不会影响Sela诱导的细胞死亡，提示Sela诱导的结肠癌细胞生长抑制可能涉及其他机制。

自噬是一个基本的分解代谢过程，它捕捉不必要的或功能失调的细胞成分，并与溶酶体融合进行降解[15]。自噬在癌症治疗中的作用是有争议的[16-17]。一方面，自噬可能促进细胞死亡[18-19]；另一方面，自噬可能在耐药性方面发挥支持作用[14]。本研究发现，Sela使SW480细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ转换增加，外源性GFP-LC3荧光斑点代表的自噬体形成也明显增加，以上结果证实Sela能促进SW480细胞发生自噬，提示Sela对SW480细胞的生长抑制可能依赖于细胞自噬的发生。在多数情况下，自噬在癌症治疗的双重作用，基本上是随着自噬流的加速而发生。然而，对于自噬流受损导致的自噬停滞是否在癌症治疗中起作用，知之甚少。本研究中，Sela通过同时启动自噬和阻断自噬体-溶酶体融合来诱导自噬停滞，导致自噬体的大量积累。用Wortmannin抑制自噬体的形成可以抵消Sela对SW480细胞的生长抑制作用，而用HCQ阻断自噬体-溶酶体融合会增加SW480细胞对Sela的敏感性，表明自噬体积累可能在Sela抗结肠癌中发挥重要作用，Sela可以通过诱导自噬停滞而成为一种有希望的抗肿瘤药物。研究[20-21]表明，通过Temsirolimus（一种针对mTOR的雷帕霉素衍生物）启动自噬，结合HCQ对自噬体-溶酶体融合的阻断，在黑色素瘤中表现出明显的抗肿瘤活性。诱导自噬启动加抑制自噬溶酶体形成是否可以成为一种可选的治疗策略，还需要进一步通过临床试验加以证明。

研究[22]表明，Akt/mTOR信号通路对调节细胞增殖、血管生成、迁移和侵袭有重要作用，对Akt/mTOR途径的抑制可能会通过自噬导致细胞死亡。本研究中发现，Sela下调了p-Akt、p-mTOR及p-p70S6k的蛋白表达水平，提示Sela诱导SW480细胞自噬，可能与Sela抑制Akt/mTOR信号通路有关。虽然本研究已经初步证明AKT/mTOR信号通路可能参与Sela诱导SW480细胞自噬的启动，但Sela导致自噬流受损的具体原因仍然未知，未来可进一步探索Sela导致自噬停滞的相关机制，并在体内动物实验中进一步验证。

综上所述，Sela对SW480具有增殖抑制作用，其潜在机制可能与Sela诱导自噬的发生以及自噬体的积累有关，Akt/mTOR信号通路也在其中发挥重要作用。因此，探讨Sela在结肠癌中的潜在作用，或许可以为结肠癌的治疗提供新的思路。