壳寡聚糖对变异链球菌的抑制作用研究

2023-01-11 07:28胡馨月张越婷袁京阳齐卓群
成都医学院学报 2022年6期
关键词:龋病菌液链球菌

胡馨月,张越婷,袁京阳,齐卓群

1.兰州大学口腔医学院(兰州 730030);2.兰州大学药学院(兰州 730030)

龋病作为危害范围较广、发病率较高的一种口腔疾病,已被世界卫生组织列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一,是全球公共卫生层面上的挑战[1],对龋病的预防一直是口腔医学工作者关注和研究的重点。目前临床常采取氟制品对龋病进行预防。氟防龋的有效性已被证实,但关于其安全性的研究始终存在争议。研究[2]发现,口腔环境中已出现耐氟菌株,因此氟应用于防龋的有效性受到了挑战。除此之外,氟浓度的选择、氟制剂的稳定性、氟的不良反应[3]等问题还有待进一步研究。龋病是感染性疾病,主要致病菌包括链球菌属、乳杆菌属和放线菌属。研究[4]表明,变异链球菌与龋病有较大关联,参与了早期牙菌斑的形成,是最重要的致龋细菌之一。青霉素、红霉素、四环素等抗生素类药物具有一定的抑菌防龋效果,但长期使用或滥用易使细菌产生耐药性并引起口腔及肠道菌群失调、微生态环境紊乱而导致其他疾病[5]。因此寻求安全有效的防龋物质成为目前龋病防治研究的重点。壳寡聚糖(chitooligosaccharide,COS)是一种甲壳素衍生物,其来源丰富、提取方便,无刺激性和抗原抗体反应,且不与体液反应,具有生物可降解性和细胞亲和性等优良性能[6]。低分子量壳聚糖尤其是COS水溶性好、功能作用多样、生物活性高,适用于医药保健领域。本研究旨在分析不同浓度COS在不同酸碱条件下对变异链球菌生长的影响,探讨COS防龋的可能性。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

主要试剂:牛脑心浸出液(brain-heart infusion,BHI)培养基、COS、琼脂(MW=500)(索莱宝科技有限公司,北京);冰乙酸(富宇精细化工有限公司,天津);氢氧化钠(沪试公司,上海)。主要仪器:厌氧培养箱(Gene Science公司,美国);气浴恒温摇床(力辰公司,上海);pH计(梅特勒-托利多仪器公司,上海);多功能酶标仪(Tecan公司,瑞士)。菌株:变异链球菌 UA159(中国科学院,北京)。

1.2 方法

1.2.1 变异链球菌复苏及传代培养 将冷冻的变异链球菌从-20 ℃冰箱中拿出,解冻5 min。准备10 mL灭菌EP管、灭菌BHI培养基。所有操作于生物安全柜中进行。用接种环沾取一环变异链球菌菌液放于装有4 mL BHI培养基的EP管中轻摇,即接种成功。将EP管放入转速为100 r/min的气浴恒温摇床中过夜培养,为第1次增菌。第2次增菌从过夜培养的10 mL EP管中沾取菌液进行传代,基本操作如前,在气浴恒温摇床中振荡12 h后得到完全恢复活性的变异链球菌。

1.2.2 调节BHI培养基pH 初配得到BHI培养基经精密pH计测得pH接近7.00,将BHI培养基分装至4个50 mL EP管中,两管用1 mol/L NaOH调至pH 7.50,剩余两管用1%乙酸溶液调至pH 6.50。相同pH的液体培养基,一瓶用于溶解COS,一瓶用于96孔板中的对半稀释,目的是使稀释过程中BHI培养基的pH不被改变。

1.2.3 配制对半稀释前含有COS的BHI培养基用天平称取3.2 g COS分别溶于两管pH为6.50、7.50装有50 mL BHI的EP管中,超声振荡至完全溶解,得到一管pH为6.50、COS浓度为64 g/L的BHI培养基和一管pH为7.50、COS浓度为64 g/L的BHI培养基。

1.2.4 微孔滤膜过滤除菌 在生物安全柜中用0.22 μm孔径滤菌膜滤过4管BHI培养基,避免调节pH后有杂菌污染培养基。

1.2.5 菌液稀释 用酶标仪测得第三代变异链球菌经24 h培养的OD值,经公式换算得出菌液浓度约为1×1012个/mL,经对半稀释后菌液浓度为1×106个/mL。

1.2.6 用96孔板进行对半稀释和细菌培养 以下操作在生物安全柜中进行。将96孔板标注好对应浓度,COS组每个浓度做3个平行样品,不同pH不同浓度的COS亚组另设不含COS的对照组。取pH 6.50的BHI培养基(不含COS)100 μL注入各组。另外吸取100 μL pH 6.50(64 g/L COS)的BHI培养基,注入第 1孔反复吸打混匀,再从第1孔中抽取100 μL注入第2孔,依次类推得到从左到右COS递减的BHI培养基(此步骤不含对照组)。从右往左(低浓度至高浓度)用排枪向每孔再注入100 μL BHI培养基(不含COS),最终得到每孔为200 μL相应pH、COS浓度的培养条件。取稀释后浓度为1×106个/mL的变异链球菌菌液,向每孔中注入20 μL,然后将96孔板放入厌氧培养箱中厌氧培养(37℃,10%H2,10%CO2,80%N2)48 h。pH 7.50组别操作方法同上。

1.2.7 活菌的稀释涂布平板法计数 将厌氧培养48 h的96孔板取出观察,若空白对照组BHI培养基呈澄清棕色,则说明培养过程中无杂菌污染,可进行下一步操作。将96孔板每孔(除空白对照组)中的培养液按102、104、106倍数稀释,取稀释后的菌液0.1 mL涂布在BHI固体平板上,每个浓度做3个平行样品。将平板放入厌氧培养箱中厌氧培养(37 ℃,10%H2,10%CO2,80%N2)48 h,观察菌落生长形态,最后取菌落数30~300固体平板进行菌落形成计数。抗菌活性高低用细菌生长抑制百分率(抑菌率)和菌落形成单位(colony forming units,CFU)评价。抑菌率=(A-B)/A×100%。A:对照组培养后平均菌落数,B:COS培养后平均菌落数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据。符合正态分布的定量资料以()表示,对照组与COS组比较行t检验,多浓度比较行方差分析,不同pH组间比较采用独立样本t检验。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 不同pH条件COS对变异链球菌UA159生长的影响

pH 7.50条件下COS组各亚组的ln(CFU)值均较不含COS对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);抑菌率随COS浓度的增加而提高(表1)。pH 6.50条件下COS各亚组的ln(CFU)值均较不含COS对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);抑菌率随COS浓度的增加而提高(表 2)。

表1 pH7.50COS对变异链球菌UA159生长的影响()

表1 pH7.50COS对变异链球菌UA159生长的影响()

注:*P表示与对照组比较。

组别 n COS浓度/(g/L) ln(CFU) 抑菌率/% t P对照组 3 0 5.837±0.005 COS 1 g/L组 3 1 5.657±0.003 16.44±0.43 -53.800 <0.001*COS 2 g/L组 3 2 5.588±0.014 22.32±0.79 -24.600 <0.001*COS 4 g/L组 3 4 5.573±0.018 23.15±1.20 -17.849 <0.001*COS 8 g/L组 3 8 5.497±0.009 28.80±0.53 -38.477 <0.001*COS 16 g/L组 3 16 5.361±0.018 37.84±0.78 -41.223 <0.001*

表2 pH6.50COS对变异链球菌UA159生长的影响()

表2 pH6.50COS对变异链球菌UA159生长的影响()

注:*P表示与对照组比较。

组别 n COS浓度/(g/L) ln(CFU) 抑菌率/% t P对照组 3 0 5.836±0.028 COS 1 g/L组 3 1 5.243±0.025 44.75±2.74 -31.934 <0.001*COS 2 g/L组 3 2 5.043±0.028 54.77±0.47 -42.710 <0.001*COS 4 g/L组 3 4 4.862±0.038 62.26±0.74 -36.889 <0.001*COS 8 g/L组 3 8 4.272±0.093 78.99±1.69 -23.096 <0.001*COS 16 g/L组 3 16 3.898±0.035 85.60±0.88 -80.681 <0.001*

2.2 相同pH不同浓度COS对变异链球菌UA159生长的影响

经48 h厌氧培养(37℃,10%H2,10%CO2,80%N2)后,在相同pH条件下,随着COS浓度增长,COS组的ln(CFU)值逐渐降低,且差异均有统计学意义(P<0.05)(表 3)。

表3 相同pH不同浓度COS对变异链球菌UA159生长的影响

2.3 不同浓度和pH条件下COS对变异链球菌UA159生长的影响

经48 h厌氧培养(37℃,10%H2,10%CO2,80%N2)后,在不同浓度和pH 6.5条件下COS各亚组较pH 7.5条件下COS各亚组的ln(CFU)值降低,差异有统计学意义(P<0.05)(表 4)。

表4 不同浓度和pH条件下COS各亚组CFU对数独立样本t检验

3 讨论

20世纪初氟化物在牙齿保护方面受到重视,并逐渐演变成牙膏、漱口水、氟保护漆等防龋保健用品的重要成分,其防龋的有效性不容置疑,但过高的氟水平会导致氟中毒[7]。氯己定(洗必泰)含漱液是一种抗菌谱广的表面活性杀菌剂,临床可用于龋病及牙周疾病的防治,但长期使用氯己定防治会出现牙齿、口腔黏膜着色和味觉异常。有研究[8]表明,氯己定的降解可能产生自由基和对氯苯胺,从而造成组织伤害。因此,寻找一种安全又有效的防龋药物具有重要意义。基于COS具有良好的抑菌性能和较强的生物相容性[9],本实验进行了COS对龋病主要致病菌生长抑制作用的研究。

本研究结果显示,在相同pH条件下,COS组菌落计数均小于不含COS的对照组,且二者差异有统计学意义(P<0.05),说明小分子量COS(MW=500)对变异链球菌的生长有明确抑制作用。抑菌率计算结果表明,抑菌率随COS浓度的增加而提高,说明其对变异链球菌生长的抑制作用在一定范围内具有浓度依赖性。对研究结果进行横向对比分析,即相同浓度COS不同pH的COS亚组,pH较低组菌落计数较pH较高组少,说明COS对变异链球菌的抑制作用在酸性环境下更显著。COS生物相容性良好且不良反应较少[10],结合以上研究,COS或许可为龋病预防提供一种新思路。

鞠铎等[11]研究发现,抑菌浓度的COS对变异链球菌的粘附能力具有明显的抑制作用。结合牙菌斑生物膜的形成原因[12],笔者猜测COS对变异链球菌的生长产生明显抑制作用的原因与其粘附能力的降低相关。变异链球菌的粘附能力降低,使其不易在获得性唾液薄膜上定植,从而难以形成抵御外界环境干扰的牙菌斑生物膜,最终达到预防龋病的目的。由于口腔菌群产酸能导致牙釉质脱矿,促使龋病进展,本研究就酸碱条件对COS抑制变异链球菌生长的作用展开了进一步研究。

Chapelle等[13]研究发现,COS具有聚阳离子型电解质的特性,是一种带正电荷的小分子物质。笔者推测,COS在酸性环境下抑菌效果更好,可能由于其本身的电荷特性增加了溶解度。COS防龋应用于口腔环境长期处于酸性的基础疾病患者具有一定前景。针对一些具有基础疾病的口腔pH值变化较大患者,COS口腔环境呈酸性,pH平均值约为6.65[14]。临床上可以根据这类患者的具体情况来合理用药,以预防龋病。有研究[15]显示,化疗后有超过50%患者口腔pH值会下降,口腔颌面创伤患者口腔环境处于酸性状态(pH=4.0~5.7)[16],而pH值下降后微生物的感染率、口腔并发症发生率较高[17]。本研究对临床上存在并发症患者使用COS制品进行口腔保健具有一定参考意义。本研究亦存在不足之处,例如在实验设计上有待更加完善,未能将COS的抑菌效果同临床常用抑菌药物氯己定[18]作对比。另外,由于COS属于甲壳素类天然多糖类高分子化合物的降解物,其降解物包括分子量更高的壳聚糖等物质,在同类实验材料的选择上可以扩大范围。Chaudhry等[19]报道,壳聚糖和COS对MCF-7、HepG2、HeLa-6和 3T3细胞具有一定毒性。值得注意的是,临床上几乎未见以COS为主要成分的龋病预防产品,其产品主要分布于抗炎抗菌、抗氧化、抗高血压及用作药物的载体等医药领域[20],COS具体防龋途径还有待进一步研究。

综上所述,COS等甲壳素类衍生品来源广泛、价格低廉,在一定条件下,其抑菌作用较好且不良反应较少,在龋病预防保健品的制备方面具有一定的潜力。

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