一种基于等温扩增的便携式核酸检测系统*

谭智广，徐 征，吴梦希，刘军山

（大连理工大学辽宁省微纳米技术及系统重点实验室，辽宁 大连 116024）

0 引言

聚合酶链式反应（PCR）具有较高的特异性和灵敏度，基于PCR的核酸检测已成为病原体检测的金标准。PCR通常需要经历30～40次的扩增循环才能达到检测所需的浓度，每次循环包含变性、退火和延伸3个反应步骤，分别需要在不同温度下进行。因此，基于PCR的核酸检测技术需要对反应温度进行反复的升降温控制，无法快速得到检测结果。为此，研究人员开发了多种基于等温扩增的核酸检测技术，例如环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增等。基于等温扩增的核酸检测过程不需要进行不同温度之间的调整，对温度控制系统的要求大大降低，并且不需要变温调整时间。美国疾病控制中心的Calvert等[1]基于逆转录环介导等温扩增技术开发了快速检测尿液或血清中寨卡病毒的分析方法，能够在20～35 min的时间内获得检测结果。清华大学的Lin等[2]设计了基于微流控芯片的便携式系统，利用逆转录环介导等温扩增技术能够在50 min内同时检测4种Ebola病毒。

现场即时检测（Point-of-care testing，POCT）[3-4]是指利用便携式分析设备，在患者附近即可进行的现场检测，具有操作简单、快速等特点，在疫情防控、海关及检验检疫等领域具有广泛应用前景。日本东北大学的Wakao等[5]搭建了微型装置的便携式荧光偏振免疫分析仪，尺寸为35 cm×15 cm×15 cm，能够同时对96个独立样本中的真菌毒素进行荧光偏振免疫分析。德国杜伊斯堡-埃森大学的Tran等[6]设计了一种便携式拉曼/SERSLFA读写器，采用定制的光纤探针实现了对妊娠激素人绒毛膜促性腺激素（hGG）以及两种细胞因子IL6和IL8的检测，能够在数秒时间内获得检测结果。基于核酸扩增的POCT技术还相对较少，这主要是由于大多数的核酸检测系统体积庞大，操作复杂，无法满足便携化的要求。

为此，本文设计制作了一种基于等温扩增的便携式核酸检测系统，通过轻量化设计等使其便于携带和操作，而且检测快速，因此有望用于病原体核酸的现场即时检测。

1 总体方案设计

本文设计的核酸检测系统主要包括温度控制模块、荧光检测模块和样品移动模块，如图1所示。其中，温度控制模块能够提供核酸扩增过程所需的温度，确保反应正常高效进行。荧光检测模块提供检测所需的激发光，同时将核酸扩增产物的荧光信号采集后进行模数转换以供后续处理。样品移动模块能够移动温度控制模块对16个PCR管进行逐个扫描，使得检测系统最多可实现16个样品的同时检测，提高了检测通量。同时，该系统还配备了一台高性能工控一体机，负责进行人机交互，方便操作人员进行检测条件设置和实验结果实时分析。如图1所示，基于STM32单片机设计了带有多路串口通信和步进电机控制脉冲发生器的主控板，系统的3个功能模块通过下位主控板进行协调与控制。其中，温度控制器、荧光检测装置以及上位工控机经过RS-232串行接口总线进行指令和数据传输；样品移动模块通过步进电机驱动器由STM32单片机的定时器外设产生数字脉冲信号进行控制。此外，为了使检测系统能够实现室外操作的便携化，设计的3个功能模块均可以利用24 V直流电池进行供电。

图1 核酸检测系统总体框图

2 功能模块设计与搭建

2.1 温度控制模块

半导体制冷片是一种基于帕尔贴效应，通过调节电流的方向能够对外界进行加热或制冷的热电器件。它具有体积小、热惯性小、无噪声、可快速变温等优点，被广泛用于核酸扩增仪器的温度控制[7-10]。本文以半导体制冷片为核心设计了温度控制模块，如图2所示。半导体制冷片的非工作面采用定制的全铜针式散热器进行散热，通过在散热器外表面涂敷碳纳米管以及安装风扇加速空气流动增强其与空气换热。半导体制冷片的工作面直接与可同时放置16个PCR管的 加热 台 接触，实现对PCR管的均匀传热。为了提高升降温速率，对加热台的体积进行了优化，使其热容量尽量减小，从而降低变温过程所需的能量。为了保证各PCR管之间温度分布的均匀性，材料选用了导热性能优良的无氧铜。此外，为了减小外界环境对加热台温度的影响，同时减少非必要的热量散失，利用尼龙外壳对加热台进行了包裹，并在其内部填充了纳米气凝胶隔热毡。

图2 温度控制模块实物

选用双通道数字温度控制器对半导体制冷片进行控制，采用了开关模式电源技术，能够高效地控制电流。控制器的工作电压为24 V，输出经滤波后电流纹波小，可以减小对半导体制冷片的电流冲击，延长其使用寿命。利用热电阻进行温度反馈，通过调节控制器的PID参数，温度控制模块的平均升温速率为2.5℃/s，升温速率较快可以减小前期预热时间。该温度控制器的温度控制精度为±0.1℃，可以满足等温扩增所需的温度控制要求。

2.2 荧光检测模块

荧光检测模块主要由具有475 nm激发波长和525 nm探测波长的高精度微型荧光探测器和恒流源组成。该模块采用了正交式光路，可以避免背景噪声对荧光值测量结果的干扰。采用LED和硅光电二极管作为激发光源和光探测器，有效减小了系统的尺寸和功率。光探测器和信号处理电路安装在同一电路板上，经模数转换后通过串口输出。相比于模拟信号，数字信号输出具有更加优秀的抗干扰能力，同时这种模数转换的就近设计能够减小噪声干扰，确保光学检测的可靠性。此外，检测的光斑直径为6.5 mm，比PCR管的管口直径略大，确保了足够大的采光面积，能够有效收集荧光信号。

2.3 样品移动模块

样品移动模块的主要作用是通过移动温度控制模块，使得荧光检测模块能够对16个PCR管进行并行检测。

同步带传动方式具有平稳、静音等优点，非常适合轻便、轻载的应用场合，因此本文参考CoreXY平面运动结构[11-12]，设计了基于同步带传动的样品移动模块，如图3所示。该模块具有X轴和Y轴两个直线运动自由度，均采用步进电机进行驱动。模块的传动机构由2条同步带和7个同步带带轮组成，其中2个带轮连接步进电机的输出轴作为驱动轮。2个电机固定在机架上，移动平台的运动依赖于2个电机的协调动作，这种设计显著减小了移动模块的运动惯性，使其运动状态切换更加灵活。规定电机顺时钟转速为正，得到移动平台的运动速度为：

图3 安装控温样品台的样品移动模块局部俯视图

式中：vx和vy分别为移动平台沿X轴和Y轴方向的运动速度；ω1和ω2分别为左右电机的转速；d为电机输出同步带轮的直径。

为了保证步进电机的开环控制精度，选用了五相步进电机，其基本步距角为0.36°，可进行15级细分，有利于在移动平台运动过程中减弱或消除步进电机的低频振动，同时也能够提高电机的角度定位精度。采用光电开关实现移动平台的位置归零，使用S型加减速算法确保步进电机在启动和停止过程中速度和加速度的连续性，减小冲击，进一步提高运动平稳性。

2.4 系统控制软件

本文采用7 inch的工业平板电脑作为核酸检测系统的上位机，主要实现人机交互功能，其他功能模块的控制均由下位单片机实现。上位机通过RS-232总线将反应参数和指令传递给下位单片机，并从下位机读取温度和荧光数据。采用Python编程语言，基于PyQt5图形界面框架，设计开发了系统的图形化控制软件。该控制软件可以显示检测系统的运行进度和状态，以数值方式实时显示加热台的温度值，以及绘制荧光强度曲线。操作人员只需手动将样品放置到加热台上，点击“开始”按钮，即可开始自动化的核酸检测。待检测结束后，控制软件会自动将温度和荧光强度数据保存至电脑，用于后续的分析处理。

3 系统的应用验证

本文使用浓度为4.4×109copies/μL的黄瓜绿斑驳花叶病毒质粒作为测试样品，基于环介导等温扩增技术对其进行核酸检测。在加热台上随机选择了4个位置安放4个PCR管，其中1号、2号和3号PCR管内装有病毒质粒和扩增反应试剂，4号PCR管内只有反应试剂作为实验的阴性对照。温度控制参数为：63℃，15 s；63℃，45 s，35次温度循环。整个检测过程只需45 min，获得的核酸扩增曲线如图4所示。从图中可以看出，随着循环次数的增加，从1、2、3号PCR管中检测到的荧光信号强度逐渐增加，最后趋于平衡；由于4号PCR管内没有病毒质粒，因此从该管中检测到的荧光信号强度很弱，且不随循环次数的增加而发生变化。该实验证明了本文研制的系统可以很好地用于基于等温扩增的核酸检测。

图4 环介导等温扩增曲线

4 结束语

本文设计制造了一种基于等温扩增的便携式核酸检测系统。基于半导体制冷片构建的温度控制模块的控温精度可以达到±0.1℃；采用LED和硅光电二极管作为激发光源和光探测器有效减小了荧光检测模块的尺寸和功率，高度集成的采集电路提高了光学检测的抗干扰能力；参考CoreXY平面运动结构设计的样品移动模块，具有运动平稳、噪声低等特点，而且显著减轻了系统的重量。操作人员通过上位工控机的控制软件进行检测参数设置，发送给下位单片机控制上述模块完成检测。检测系统可以采用24 V直流电池进行供电，有利于室外操作的便携化。利用该系统，基于环介导等温扩增技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒质粒进行了核酸检测，在45 min内获得了检测结果。