乳酸菌发酵香菇对肠道菌群的调节作用及其产品研制

聂远洋，贾亚娟，卢 森，乔雪峰，李 波

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

香菇是我国的特色食用菌，含有多种营养及活性成分，如多糖、蛋白质、酚类物质、麦角甾醇、膳食纤维等[1-3]，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、增强机体免疫力、护肝等多种生理功能[4-6]。近年来，我国香菇种植业发展迅速，产量持续增长，2020年产量为1 188 万吨[7]，成为世界第一大食用菌品种，在脱贫攻坚和乡村振兴中发挥了重要作用。目前香菇以鲜品和干品为主，加工程度低、产品品种少、附加值不高，导致产销矛盾日益突出。因此，大力发展香菇精深加工技术，延长产业链，是保障香菇产业健康可持续发展的必要途径。

乳酸菌除用于乳制品发酵外，还常用于果蔬发酵。研究表明，利用乳酸菌发酵可明显改善发酵果蔬的风味、营养和安全性等[8-10]。香菇中丰富的营养成分能够为乳酸菌生长提供营养物质基础，因此可作为乳酸菌发酵的底物。乳酸菌可将香菇中的蛋白质分解为氨基酸，使其更易消化吸收。通过发酵，乳酸菌大量增殖，产生大量的有机酸，人体摄入这些乳酸菌和有机酸，可以通过降低肠道pH 和抑制腐败菌、病原菌的生长来调节肠道微生态平衡[11]。乳酸菌将碳水化合物和蛋白质分解成乳酸、乙醇、醋酸、氨基酸等物质，并进一步生成酮类、醛类、醇类、酯类等多种风味物质[12-13]，对发酵香菇独特风味的形成起着关键作用。另外，很多乳酸菌都是益生菌，其代谢产物也含有多种对人体有益的功能性成分[14]。

在前期研究中，作者筛选出了适合香菇发酵的乳酸菌复合发酵剂，对其发酵工艺进行了优化，分析测定了发酵前后其挥发性风味物质的变化情况，为香菇的乳酸菌发酵类食品开发提供了应用基础[8]。因此，在前期基础之上，通过动物实验，研究乳酸菌发酵香菇在小鼠体内调节肠道菌群的活性，并将其开发成调味即食食品，优化制作工艺，以期为香菇功能性食品开发提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜香菇、白砂糖、生姜、辣椒粉、熟白芝麻：购自本地超市；甜面酱、豆瓣酱：烟台欣和企业食品有限公司产品；菜籽油：山东鲁花集团有限公司产品；藤椒油：嘉里粮油（四川）有限公司产品；无水葡萄糖（食品级）：江西省每伴食品有限公司产品；食用盐：河南省盐业集团有限公司产品；无菌纱布：南昌市奥康医疗器械有限公司产品；德氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳杆菌冻干菌种：郑州和合生物工程技术有限公司产品；鼠李糖乳杆菌冻干菌种：广东省微生物菌种保藏中心提供；SPF 级雄性昆明小鼠：斯贝福（北京）生物技术有限公司提供；清洁级动物饲料、垫料、鼠笼、饮水瓶：江苏省协同医药生物工程有限责任公司产品；无菌冻存管：美国Corning 公司产品。

1.2 仪器与设备

XFH-50CA 电热式压力蒸汽灭菌器：浙江新丰医疗器械有限公司产品；SW-CJ-IBU 超净工作台：苏州苏净集团产品；GSP-9080MBE 隔水式恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；JYL-C16D 厨房机械（料理机）：九阳股份有限公司产品；YDS-50B-125 液氮罐：乐山市东亚机电工贸有限公司产品；NovaSeq6000 PE250 测序平台：美国Illumina 公司产品。

1.3 方法

1.3.1 香菇的乳酸菌发酵新鲜香菇经去除杂质后清洗晾干，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的香菇块。取适量香菇块按料液质量比1∶1 加入蒸馏水，再添加质量分数1.0%食盐和2.0%葡萄糖 （以香菇和蒸馏水总质量为基准），115 ℃高压灭菌10 min，冷却后接种质量分数2.7%的复合乳酸菌发酵剂（德氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌质量比为3∶1∶2），37 ℃恒温发酵48 h 后备用[8]。

1.3.2 动物实验SPF 级雄性昆明小鼠50 只，5 周龄，24～26 g。将小鼠随机分成5 组，每组10 只，在室内温度为（24±1） ℃，相对湿度为60%±5%，每天明暗时间各12 h 的条件下，用基础维持型鼠粮饲养各组小鼠，自由摄食饮水，自由活动。各组小鼠先适应性饲养1 周，然后开始灌胃，其中空白对照组灌胃等剂量的蒸馏水。小鼠分组及灌胃剂量见表1。

表1 动物实验设计Table 1 Animal experimental design

1.3.3 肠道菌群16S rRNA 高通量测序取适量小鼠结肠内容物至无菌冻存管，立即放入液氮中保存备用。采用CTAB/SDS 法提取小鼠肠道内容物总基因组DNA，用引物341F 5′-CCTAYGGGRBG CASCAG-3′和引物806R 5′-GGACTACNNGGGT ATCTAAT-3′扩增16S rRNA V3-V4 区。随后构建文库，将构建好的文库进行Qubit 和Q-PCR 定量；待文库合格后，使用NovaSeq6000 PE250 测序平台进行高通量测序。样本检测、DNA 提取、PCR、纯化、建库、测序均由北京诺禾致源生物科技有限公司完成。

1.3.4 生物信息学分析采用QIIME2 软件 （版本号QIIME2-202006） 中的DADA2 模块对全部有效数据进行降噪，并过滤掉丰度小于5 的序列，从而获得最终的扩增子序列变异 （amplicon sequence variants，ASVs）以及特征表。随后使用QIIME2 软件中的classify-sklearn 模块将得到的ASVs 与数据库比对，从而得到每个ASV 的物种信息。采用QIIME2软件计算物种的相对丰度，并进行样本Alpha 多样性和Beta 多样性分析。

1.3.5 乳酸菌发酵香菇调味产品的制作工艺

调味：取发酵好的香菇块控干（不滴发酵液为止），然后加入甜面酱、豆瓣酱、白砂糖、藤椒油、辣椒、姜汁、熟白芝麻等调味料拌制均匀。

包装：准确称取调味发酵香菇块15 g，装入耐高温蒸煮袋，真空密封。

杀菌：将包装好的调味香菇在121 ℃杀菌15 min，取出冷却，即得成品。

1.3.6 单因素实验乳酸菌发酵香菇调味产品的基础配方：发酵香菇块84.0%、白砂糖4.0%、辣椒4.0%、姜汁1.0%、熟白芝麻2.0%、藤椒油2.5%、甜面酱和豆瓣酱共2.5%（均为质量分数）。

分别选取甜面酱和豆瓣酱质量比 （0.50∶2.00、1.00∶1.50、1.25∶1.25、1.50∶1.00、2.00∶0.50）、白砂糖添加量 （质量分数3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%）、藤椒油添加量 （质量分数2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）为3 个因素，以感官评分为指标，研究调味发酵香菇产品中甜面酱和豆瓣酱最适质量比、白砂糖、藤椒油的最适添加量。

1.3.7 响应面实验在单因素实验基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken 实验设计。以甜面酱和豆瓣酱质量比（A）、白砂糖添加质量分数（B）和藤椒油添加质量分数（C）为因素，感官评分为响应值，对调味发酵香菇制作工艺进行优化，因素与水平设计见表2。

表2 响应面实验因素与水平表Table 2 Factors and levels of response surface test

1.3.8 感官评定由10 名经过培训的人员组成感官评定小组，对乳酸菌发酵香菇调味产品的色泽、口感、气味、组织状态进行感官评分。评分标准见表3[15]。

表3 乳酸菌发酵香菇调味产品的感官评分标准Table 3 Sensory evaluation criteria of flavored Lentinus edodes fermented by lactic acid bacteria

1.4 数据处理

所有实验均重复3 次，结果用平均值±标准差表示，实验数据采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。多重比较采用LSD 法和Dunnett’s T3 法，P＜0.05 具有显著性差异。采用Origin 9.0 软件绘图。采用Design-expert 8.0.6 软件进行Box-Behnken 响应面优化实验设计和统计分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵香菇对小鼠肠道菌群的调节作用

2.1.1 肠道菌群Alpha 多样性指数差异对各组样本在97%一致性阈值下的Alpha 多样性指数（chao1、observed species、shannon、simpson） 进行统计，结果见图1。chao1 和observed species 指数主要用于统计群落中的物种总数，且当群落中低丰度物种越多时，chao1 指数越大[16]；shannon 和simpson 指数用于表征群落中物种的多样性及均匀性，指数越大，多样性越高，物种分布越均匀[17]。与空白对照组相比，各处理组的chao1 和observed species 指数均在一定程度上增加但不显著（P＞0.05），其中FM 组增加幅度最大，表明灌胃中剂量的乳酸菌发酵香菇丰富了小鼠肠道中低丰度的物种，即稀有物种或特有物种。FC、FL 和FH 组的shannon 和simpson 指数与对照组均无显著差异，而FM 组有所增加但不显著（P＞0.05），表明灌胃中剂量的乳酸菌发酵香菇在一定程度上丰富了小鼠肠道中的菌群多样性，且分布更均匀。另外，乳酸菌发酵香菇对小鼠肠道菌群Alpha 多样性的影响与灌胃剂量有一定相关性，但过高的剂量带来相反的效果，可能与小鼠对剂量的适应性和应激反应有关。

图1 乳酸菌发酵香菇对小鼠肠道菌群Alpha 多样性的影响Fig.1 Effects of Lentinus edodes fermented by lactic acid bacteria on the Alpha-diversity of gut microbiota in mice

2.1.2 肠道菌群Beta 多样性指数差异Beta 多样性主要用于评估不同样本组间的微生物群落构成差异。基于unweighted unifrac 距离进行的PCoA 和Anosim 分析结果见图2。第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）贡献值分别为26.46%和7.81%，从各样本间距离来看，各组内大多数样本间距较小，表明个体差异较小，FM 组的个体样本离散程度最低。与对照组相比，各处理组的R均大于0，说明组间差异大于组内差异[18]，除FH 组与对照组无显著性差异（P=0.289）外，其余各组与对照组均有显著性差异（P＜0.05），表明组间差异明显。因此，乳酸菌发酵香菇改变了小鼠肠道菌群的Beta 多样性，对个体差异影响较小，物种分布更均匀。

图2 乳酸菌发酵香菇对小鼠肠道菌群Beta 多样性的影响Fig.2 Effects of Lentinus edodes fermented by lactic acid bacteria on the Beta-diversity of gut microbiota in mice

2.1.3 肠道菌群物种分布和相对丰度差异根据门分类水平上的物种注释结果，选取相对丰度前10的物种进行统计分析，结果见图3。在门水平上，对照组和所有处理组中的优势肠道菌群均属于厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）两大门类。其中，对照组和FC 组分别占86.80%、85.23%，发酵香菇组（FL、FM、FH）分别占82.57%、82.37%、80.70%，表明乳酸菌发酵香菇降低了小鼠肠道中两大主要门类菌群总的相对丰度，增加了其他门类菌群的相对丰度，尤其是稀有物种或特有物种，这与Alpha 多样性分析结果一致。此外弯曲杆菌门（Campilobacterota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、脱铁杆菌门（Deferribacterota）、变形菌门（Proteobacteria）等的相对丰度为2%～10%，其他含量较少的疣微菌门（Verrucomicrobia）、髌骨菌门（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）等的相对丰度在1%左右。

图3 乳酸菌发酵香菇对小鼠肠道菌群门水平物种分布和相对丰度的影响Fig.3 Effects of Lentinus edodes fermented by lactic acid bacteria on the distribution and relative abundance of gut microbiota at phylum level in mice

在属分类水平上，优势菌群主要包括Muribaculaceae、乳杆菌属（Lactobacillus）、Dubosiella、Lachnospiraceae、螺杆菌属（Helicobacter）、支原体（Mycoplasma）等。如图4（a）所示，除FH 组与对照组Muribaculaceae的相对丰度相比有显著性（P＜0.05）下降外，其余各组无明显变化。从乳杆菌属相对丰度的变化可以看出（见图4（b）），FC、FL 组与对照组相比无明显变化，而FM 和FH 组显著增加，且灌胃剂量越大差异越显著，这可能与灌胃的发酵香菇中乳酸菌的含量存在依从性。由图4（c）可知，除FM组的Dubosiella相对丰度与对照组相比有极显著增加外 （P＜0.01），其余各组无显著变化。而在Lachnospiraceae相对丰度的变化上，各处理组均显著增加，FM 组增加幅度最大（见图4（d））。螺杆菌属相对丰度的变化情况表明（见图4（e）），与对照组相比，FM 组有所降低但不显著，其余各处理无显著变化。由图4（f）可知，除FC 组支原体相对丰度下降不明显外，其余各处理组显著下降。

图4 乳酸菌发酵香菇对小鼠肠道菌群属水平主要物种相对丰度的影响Fig.4 Effects of Lentinus edodes fermented by lactic acid bacteria on the relative abundance of main species in gut microbiota of mice at genus level

Muribaculaceae是小鼠肠道中的优势菌群，富含分解碳水化合物的酶系，可代谢产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），促进肠上皮细胞的生长发育[19]。此外，Lachnospiraceae也是SCFAs 的重要生产者，能够提供能量并选择性上调紧密连接蛋白的表达，促进肠上皮的完整性[20]。常见的益生菌如乳杆菌属包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等，可以促进抗炎因子的分泌、调节肠道微生物群、缓解便秘症状[21]。Dubosiella被认为是具有调节体内代谢、提高肠道免疫力和促进机体抵抗炎症疾病等功效的一类肠道菌属[22]。而螺杆菌属为变形菌门细菌，多属致病菌，如幽门螺杆菌、肝螺杆菌等。因此，通过灌胃乳酸菌发酵香菇可不同程度地增加小鼠肠道内有益微生物如Muribaculaceae、乳杆菌属、Dubosiella、Lachnospiraceae等的相对丰度，降低螺杆菌属、支原体等致病菌的相对丰度，从而调节肠道菌群结构、改善肠道健康。

2.2 乳酸菌发酵香菇调味产品的制作工艺

2.2.1 单因素实验结果香菇经乳酸菌发酵后呈现较浓郁的酸味，不适合直接食用，需进行调味处理。根据发酵香菇特性，结合市场调研，在预实验基础上通过添加白砂糖、辣椒、姜汁、熟白芝麻、藤椒油、甜面酱、豆瓣酱等进行风味调节，并研究了甜面酱豆瓣酱质量比、白砂糖和藤椒油添加量对产品品质的影响。甜面酱在味型上属咸中带甜[23]，豆瓣酱则以咸、鲜为主[24]，可以增加发酵香菇的酱香味，改善产品色泽。糖在调味工艺中具有提鲜、增甜的作用[25]，可以使发酵香菇的酸味更加柔和，且略带甜味。藤椒油以麻、香为风味特色[26]，可以增加发酵香菇的麻、香味感。由图5可知，甜面酱与豆瓣酱最适添加质量比为1.00∶1.50，白砂糖最适添加量为6.0%，藤椒油最适添加量为3.0%（均为质量分数）。添加过多的调味料均会掩盖乳酸菌发酵香菇的酸味和独特风味，导致感官评分下降。

图5 甜面酱豆瓣酱质量比、白砂糖和藤椒油添加量对发酵香菇调味产品感官评分的影响Fig.5 Effect of the mass ratio of sweet flour sauce to broad bean paste,the amounts of white granulated sugar and rattan pepper oil on the sensory scores of flavored Lentinus edodes fermented by lactic acid bacteria

2.2.2 响应面实验优化结果在单因素实验的基础上，以感官评分为响应值，采用Box-Behnken 响应面实验，确定发酵香菇调味制品的最佳配方。响应面实验结果和回归模型方差分析分别见表4和表5。由回归分析结果得到调味发酵香菇制品感官评分与甜面酱与豆瓣酱质量比、白砂糖添加量、藤椒油添加量3 个因素的二次多项回归方程如下：

表4 响应面实验结果Table 4 Results of response surface experiment

Y= 87.40+1.19A-0.31B+0.63C-1.38AB-0.50AC+0.75BC-1.89A2-2.64B2-1.51C2

由表5可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05）。由一次项F可知，各因素对调味发酵香菇感官评分的影响顺序为：甜面酱与豆瓣酱质量比＞藤椒油添加量＞白砂糖添加量。A、AB、A2、B2、C2项对调味发酵香菇感官评分影响极显著，C、BC项对感官评分影响显著，其余项对感官评分影响不显著。回归模型中的相关系数R2和R2adj分别为0.800 4和0.931 8，变异系数为0.73%，说明模型拟合度较好，可靠性良好，可用此方程预测调味发酵香菇工艺配方的感官评分。

表5 回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

通过响应面实验优化，预测最佳调味工艺配方为：甜面酱与豆瓣酱质量比为1.00∶1.50、白砂糖6.0%、藤椒油3.0%（均为质量分数），此时感官评分为87.4 分。经过3 次验证实验，实际感官评分为87.0 分，与预测值接近，说明二次回归方程具有较高的可靠性，可用于实际操作中预测调味发酵香菇的感官评分。

3 结 语

通过小鼠灌胃实验研究了乳酸菌发酵香菇对小鼠肠道菌群的调节作用，结果表明，发酵香菇改变了小鼠肠道菌群的物种多样性，其特有物种和稀有物种数量增加，且个体差异减小，物种分布更均匀。在菌群的门分类水平上，对照组和所有处理组中的优势肠道菌群均属于厚壁菌门和拟杆菌门两大门类，乳酸菌发酵香菇降低了小鼠肠道中这两大主要门类菌群总的相对丰度，增加了其他门类菌群的相对丰度。在属分类水平上，各处理组相对丰度较高的有Muribaculaceae、乳杆菌属、Dubosiella、Lachnospiraceae、螺杆菌属等，乳酸菌发酵香菇可不同程度地增加小鼠肠道内有益微生物如Muribaculaceae、乳杆菌属、Dubosiella、Lachnos-piraceae等的相对丰度，降低螺杆菌属、支原体等致病菌的相对丰度，表明乳酸菌发酵香菇能够调节小鼠肠道菌群结构，增加有益菌在肠道内的定殖，可能具有提高肠道免疫功能进而改善肠道健康的作用。乳酸菌发酵香菇调味即食产品的最佳配方为：发酵香菇块81.5%、甜面酱1.0%、豆瓣酱1.5 %、白砂糖6.0%、藤椒油3.0%、芝麻2.0%、辣椒油4.0%、姜汁1.0%（均为质量分数）。按此配方制得的成品滑嫩爽口、酸辣适中、风味独特。作者在前期香菇的乳酸菌发酵工艺研究基础之上进行了调节肠道菌群的功效研究和调味产品开发，具有较好的实际应用前景。