新疆南疆部分规模化羊场粪肠球菌的毒力基因及耐药基因的检测

邢潇月，胡亚辉 ，张家浩，阿迪莱·卡哈曼，李莲瑞★

（1. 塔里木大学动物科学与技术学院 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室 843300）

粪肠球菌属于链球菌科、肠球菌属，是人类和动物肠道中的正常菌群。它广泛存在于自然界中，能够在粪便中检出，可以和其他胃肠道益生菌和谐共处[1]，并能够产生L型乳酸和细菌素，抑制肠道微生物生长，具有维护动物和人肠道健康等作用。

但有时粪肠球菌又是机会致病菌，当宿主身体出现抵抗力下降，肠道内微生物失衡，就能引起动物疾病。粪肠球菌常引发人和动物的泌尿系统感染、脑膜炎、菌血症等疾病[2]，据调查，近年来粪肠球菌引起动物和人类疾病的例子逐渐增多，在羊养殖业中危害也较大，对羔羊的致死率达到20%[3]。粪肠球菌由于细胞壁坚厚，具有天然的耐药性，给药物治疗带来一定困难。故对新疆南疆部分地区羊养殖场粪肠球菌的耐药基因及毒力基因进行检测，为新疆南疆部分规模化羊养殖场防控粪肠球菌提供一定基础。

本实验参考欧都·吾吐那生、齐亚银、卜三平等[4]的粪肠球菌快速鉴定方法，筛选粪肠球菌，并用普通PCR方法检测粪肠球菌是否携带耐药基因及粪肠球菌。

1 材料

1.1 试验材料

1.1.1 病料

在新疆巴音郭楞蒙古自治州、阿克苏地区、喀什地区的部分规模化羊养殖场采集病羊、死羊的肺脏、肝脏、淋巴结、胆囊等组织，将采集组织放入-20℃保存。

1.1.2 生化鉴定试剂

精氨酸双水解酶、产酸松三糖、产酸蔗糖、产酸棉籽糖、产酸甘露醇。

1.1.3 培养基

KF链球菌培养基，肠球菌培养基。

1.1.4 试剂

基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技北京有限责任公司。

2 方法

2.1 分离培养

将采集的病料切成1cm3大小的方块，放入2mL离心管，并加入1颗钢珠，放入研磨机中研磨3min；吸取10μL研磨好的浆液均匀滴在KF链球菌培养基上。37℃在电热恒温培养箱中培养±48h，挑出暗红色至粉色菌落转入肠球菌肉汤培养基，37℃培养±24h进行形态学观察。

2.2 分离株的生化特性鉴定

将上一步获得的可疑菌纯培养物接种在精氨酸双水解酶、产酸松三糖、产酸蔗糖、产酸棉籽糖、产酸甘露醇中[6]，37℃培养24h，根据反应现象能分辨链球菌和肠球菌。

2.3 tuf特异性基因扩增鉴定

严格按照北京天根生化科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，将提取的DNA于-20℃保存。

根据肠球菌的tuf[7]基因设计特异性引物（引物序列由上海生物工程有限公司合成）。PF：TACTGACAAACCATTCATGATG，PR：AACTTCGTCACCAACGCGAAC，预计扩增判断大小为112 bp。特异性片段的扩增的条件：运用提取的DNA 为模板进行 PCR 扩增， 反应体系如下：DNA 模板1μL，PF（10μmol/L）0.5μL，PR（10μmol/L）0.5μL，PremixT a12.5μL，超纯水 10.5μL，总体系为25μL。反应条件：预变性，94℃，3min；变性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸，72℃，30s；循环数为30[8]，再延伸，72℃，10min。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带。

2.4 耐药基因引物的合成及检测

以2.3.1 提取的 DNA 为模板，参照文献[11]设计引物，用PCR方法对粪肠球菌进行耐药基因检测，引物序列由上海生工合成。耐药基因PCR反应条件[11]：tetM：95℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，45s；72℃,10min,30个循环。ermB：94℃，5min；94℃，30s；48℃，30s；72℃，45s；72℃，10min，30个循环。TEM：95℃，5min；94℃，30s；51℃，30s；72℃，45s；72℃,10min,30个循环。

表1 耐药基因引物序列

2.5 毒力基因引物的合成及检测

以2.3.1 提取的 DNA 为模板，参考文献[12]设计引物，用PCR方法对粪肠球菌进行毒力基因检测，引物序列由上海生工合成。

毒力基因 引物序列ylA F:ACTCGGGGA（5'-3'） 预计扩增片段大小（bp）C R:GCTGCT F:ACAGAAGATTGATAGGC AAGCTGCGCTT 688 hyl GCTGCAGGAAATG R:CACTGACGTCCAAGTTTCCAA 276 alas F:GCACGCTATTACGAACTATGA R:TAAGAAAGAACATCACCACGA 375

毒力基因PCR反应条件：CylA：94℃，5min；94℃,30s；54℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32个循环。Hyl：94℃，5min；94℃，30s；54℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32个循环。alas：94℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32个循环。

3 结果

3.1 细菌分离培养结果

粪肠球菌为革兰阳性球菌，呈球形或椭圆形，成对或链状排列，结果见图1。

图1 革兰染色镜检图（10×100）

3.2 生化鉴定结果

选取5株疑似菌进行生化鉴定，除产酸棉籽糖为阴性，产酸松三糖为弱阳性，其他均为阳性，结果见表2。

表2 生化鉴定结果

3.3 鉴定结果

3.3.1 tuf基因鉴定结果

结果见图2，可见目的基因大小为112bp，与预期大小相符。

图2 tuf基因PCR特异性检测

3.4 粪肠球菌耐药基因检测结果

对粪肠球菌进行3种耐药基因扩增，其中大环内酯类ermB耐药基因被检出。如图3。

图3 ermB基因PCR产物电泳图

根据结果显示，大环内酯类耐药基因ermB基因有51株，检出率为47.2%。

3.5 粪肠球菌毒力基因检测结果

对粪肠球菌进行3种耐药基因扩增，其中alas耐药基因被检出。如图4。

图4 alas毒力基因PCR产物电泳图

根据结果显示，携带alas毒力基因的粪肠球菌有31株，检出率为28.7%。

4 分析与讨论

近年来，粪肠球菌作为机会致病菌对畜牧业的危害逐渐增大，原因是多方面的，首先，细胞壁坚厚等自身因素，使其具有天然的耐药性；其次，抗生素的广泛使用，也增强了粪肠球菌的耐药性[12]。根据调查，新疆南疆地区对羊源性粪肠球菌不够重视，导致发病率居高不下，严重危害羊养殖业发展，且新疆地区昼夜温差大，饲养环境难控制，容易导致羊群抵抗力下降，给粪肠球菌可乘之机，侵入动物机体内，从而引起感染。本实验探究新疆南疆地区粪肠球菌的毒力基因以及耐药基因，为南疆地区治疗粪肠球菌感染疾病提供一定基础。本实验采集新疆南疆地区部分规模化羊养殖场份病料进行分离鉴定，生化鉴定、并进行细菌的特异性tuf基因鉴定，共分离出108株粪肠球菌。对粪肠球菌进行4种耐药基因以及4种毒力基因的检测，其中四环素类tetM耐药基因以及大环内酯类ermB耐药基因被检出，毒力基因alas被检出，结果表明，新疆南疆部分规模化羊养殖场正在受粪肠球菌的侵害，并且这些粪肠球菌携带耐药基因与毒力基因。

5 结论

粪肠球菌在南疆部分规模化羊养殖场中存在，并存在耐药基因和毒力基因。