大米中2-乙酰基-1-吡咯啉检测技术及形成机制研究进展

刘洪斌，段晓亮，李 颖，赵璐瑶✉

（1.中国动物疫病预防控制中心，北京 100020；2.国家粮食和物资储备局科学研究院 粮食品质与营养研究所，北京 100037）

大米作为我国居民的主食之一，其品质一直备受消费者和科研人员的关注。研究结果表明，大米的香味由多种挥发物组成，包括烃类、芳烃类、醛类、酮类、酯类、酸类、醇类、烯及烯醇类、杂环化合物等[1]。在所有挥发物中，2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）是目前研究最多的大米特征性香气成分[2]，其含量的高低直接影响大米的品质与价格。

2-AP是一种沸点较低的小分子杂环化合物，其相对分子质量为 111.14，具有烤面包味、坚果味及爆米花味[3]，在空气中的气味阈值很低（0.02～0.04 ng/L），因此在大米蒸煮过程中很容易被闻到[4]。但是，2-AP在大米中的含量通常低至μg/kg，在用现代分析方法检测过程中，仪器灵敏度低、基质干扰、色谱分离共流出等问题会导致 2-AP检测不出[5]，或存在检测结果不稳定、回收率低等问题。因此，如何建立适当的检测方法，以实现对2-AP的精确测定非常重要。

到目前为止，2-AP的检测方法主要有气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、气相色谱-质谱法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）、气相色谱-串联质谱法（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）、气相色谱-飞行时间质谱法（Gas Chromatography-Time of Flight-Mass Spectrometry，GC-TOF-MS）、全二维气相色谱-飞行时间质谱法（Two Dimensional Gas Chromatography-Time of Flight-Mass Spectrometry，GC×GC-TOF-MS）、气相质谱-嗅闻-质谱法（Gas Chromatography-Olfactometry-Mass Spectrometry，GC-O-MS）及高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等。本文综述了2-AP各种前处理方法、检测方法的优缺点，以及2-AP形成机制的研究进展，并展望了未来的发展方向。

1 样品前处理方法

1.1 水蒸馏法

水蒸馏法是提取植物样品中挥发成分最常见的方法之一。在蒸馏过程中，可通过减少装置内的压力而降低沸点，从而在较低的温度下即可收集到待测组分，避免待测组分的分解。Sugunya等[6]采用水蒸馏法、氮磷检测器（Nitrogen Phosphorus Detector，NPD）和高选择性的色谱柱CP-Wax 51测定了考道马里105糙米中包含2-AP在内的140种挥发化合物，样品用量为0.5 g，内标为 2,4,6-trimethylpyridine（TMP），并对 2-AP等挥发物进行了相对定量分析，但未对方法的检测限和定量限等参数进行评估。在蒸馏过程中，随水蒸气蒸发的 2-AP需要经过冷凝管冷凝后收集，因此耗时较长。

1.2 同时蒸馏萃取法

同时蒸馏萃取法（simultaneous distillationextraction，SDE）将水蒸气蒸馏和溶剂萃取的过程合二为一，Buttery等[7]将水和乙醚作为萃取溶剂，在高温（100 ℃）下进行2-AP的萃取，样品用量为0.5 g，GC-MS结果显示10 种香米中2-AP的含量为 0.006～0.09 mg/kg。SDE法提取温度较高，可能会造成 2-AP的损失。SDE法相比蒸馏法，在减少冷凝时间的同时，也降低了2-AP在转移过程中的损失。

1.3 溶剂萃取法

溶剂萃取法是利用大米样品中包含 2-AP的各组分在溶剂中的溶解性质差异而达到分离的效果。Hien等[8]直接用400 mL纯乙醇为萃取溶剂，将100 mg大米粉末在70 ℃下萃取2 h后高速离心，上清液直接进行 GC-MS检测，结果不同品种大米中 2-AP的含量为0～430.7 μg/kg。溶剂萃取法操作温度低，相比蒸馏法和同时蒸馏萃取法，减少了2-AP在萃取过程中的降解，操作方便。但有时受基质影响严重，可能造成结果失真。

1.4 固相微萃取法

固相微萃取法（Solid Phase Micro Extraction，SPME）是基于涂有固定相的熔融石英纤维来吸附、富集样品中待测物质的一种前处理方法。SPME法集采样、萃取、浓缩于一体，前处理速度快，是目前食品中挥发性成分分析主要的前处理方法之一。SPME法的萃取效果除受样品基质影响外，还可能受纤维涂层类型、萃取温度、萃取时间等多因素的影响。Hopfer等[9]测试了不同SPME纤维从大米中提取和解吸2-AP的能力，结果显示两种混合纤维（二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷和二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷对2-AP的提取率最高，GC-MS/MS的检测限和定量限可达到pg级，分别为3 pg/g和39 pg/g。因此，将SPME技术和GC-MS/MS联用，可大大提高分析2-AP的灵敏度。目前，传统水蒸馏法、溶剂萃取法等前处理方法正逐渐被自动化固相微萃取技术取代，随着新型性能更加稳定的SPME的研制，SPME顶空进样结合GC-MS/MS技术将越来越多地应用于大米2-AP的分析中。

2 检测方法

以 GC为基础的检测方法常用于分析小分子低沸点的弱极性化合物，因此非常适合分析2-AP，因此2-AP的检测方法大多以GC为基础，通过结合不同的检测器，来达到对2-AP的定性和定量分析。

2.1 GC-FID/NPD

在GC分析2-AP的过程中，以2-AP在色谱柱上的保留时间进行定性，即通过对比样品中2-AP的保留时间和标准品的保留时间，来确认样品中是否含有2-AP。常用的检测器有火焰离子化检测器（Flame Ionization Detector，FID）及氮磷检测器（Nitrogen Phosphorus Detector，NPD）。有研究结果表明，在采用大口径熔融石英毛细管柱和顶空进样检测香米中的2-AP时，NPD比FID的灵敏度更高，检测限分别为5 ng/g和20 ng/g[10]。

GC法本身灵敏度低，且GC分离时，样品基质中与2-AP性质相似的物质可能会与2-AP共流出，会对测定结果的准确性造成很大影响。因此，选择合适的检测器及更适合分离2-AP的色谱柱，对于2-AP的定量分析非常关键。

2.2 GC-MS

在检测2-AP时，相比FID及NPD等检测器，质谱检测器的灵敏度更高、定性能力更强，因此GC-MS更适于大米中 2-AP的测定。顶空进样-固相微萃取技术（Headspace-Solid Phase Micro Extraction，HS-SPME）集采集、萃取、浓缩和进样于一体，是目前国际上比较流行的检测微量挥发性有机物的方法[11]。在GC-MS对2-AP进行测定时，常采用选择性离子检测（Selected ion Monitor，SIM）法，即采集用于 2-AP定量分析离子（m/z 111、83、68），通过内标物的标准曲线进行定量。

Lee等[12]采用HS-SPME结合GC-MS法，研究了预包装大米饭中 2-AP的检测方法，结果显示，在20 mL顶空瓶中将1 000 ng的2-AP同位素内标加入4 g预包装米饭中，可以获得较好的回收率（78.25%～99.91%）和线性范围（9.91～126.67 ng/g，R2=0.999 8），对于定量测定米饭中的2-AP有较好的准确度（RSD=2.7%）。

GC-MS是目前2-AP检测领域使用最多、应用范围最广的技术，虽然灵敏度比 GC更高，但是由于大米本身基质比较复杂，也会遇到检测结果不稳定，重现性差等问题，因此并不适用于2-AP的精确测定。

2.3 GC-MS/MS

相比 GC-MS，GC-MS/MS的检测灵敏度更高，更加适合对微量及痕量水平挥发物的分析。在采用GC-MS/MS分析时，除了标准品和保留时间，基于全扫描条件下2-AP的碎片离子丰度特征以及NIST标准谱库中2-AP的碎片离子都可以对2-AP进行定性[13]。而对于大米中2-AP 的定量，使用最多的还是内标法，常用的非同位素内标主要有2,6-二甲基吡啶（2,6-DMP）、2,4,6-三甲基吡啶（TMP）及 2-乙酰基吡咯（2-Pyr）等。TMP具有与2-AP相似的物理化学性质，且结构稳定，保留时间与2-AP也比较接近，因此较其他内标的使用范围更广。但有研究表明，在质谱总离子流图中，TMP峰会和大米中的其他组分发生重叠。因此，与TMP性质类似的2,6-DMP，以及与2-AP性质更为接近的2-Pyr也会用作2-AP定量的内标。

相比非同位素内标，稳定同位素内标在对2-AP进行定量分析时优势更加明显，近年来已经取得了广泛应用。目前，2-AP最常用的同位素内标为氘代 2-AP-（CD3）和13C标记的 2-AP-（13CH3）。此外，Maraval等[14]以 2-AP-d2（吡咯环上的5号位2个H被D取代）为内标，结合GC-MS/MS实现了香米中 2-AP的精确定量，线性范围为 5.9～779 ng/g（R2=0.998 9），检测限和定量限分别为0.1 ng/g和0.4 ng/g。

当前，美国对香米（如巴斯马蒂）的需求正在增加，通常香米中2-AP的含量较高。在香米育种筛选实验中，由于样品比较珍贵，通常需要在单粒大米水平上对 2-AP的含量进行精准检测。Helene等[9]将HS-SPME结合GC-MS/MS用于分析单粒大米样品中的 2-AP，SPME萃取温度为40 ℃，采用同位素内标[2H2-6]-2AP进行定量，结果显示2-AP的线性范围在53～5 380 pg/g之间，检测限低于2-AP的阈值（0.02～0.04 ng/L）。

因此，GC-MS/MS的灵敏度和稳定性相比GC-MS更高，且能够在单粒大米水平分析 2-AP的含量，对于样品珍贵的育种试验意义显著，对于促进香米育种、建立痕量检测2-AP的标准也都有重要意义。但是，GC-MS/MS需要温度较高的前处理过程，如能优化前处理方法，避免高温导致的2-AP降解，GC-MS/MS将是目前GC相关方法中最有前景建立2-AP准确定量的技术。

2.4 GC-TOF-MS

研究人员除采用常规的 GC-FID/NPD或GC-MS方法外，还采用GC-TOF-MS对大米样品中的2-AP进行测定。Ali等[15]采用冷纤维SPME结合GC-TOF-MS测定了9个伊朗香米和2个印度香米中2-AP的含量，结果显示，与商用SPME相比，实验室改性的冷纤维SPME也能够准确地识别出样品中的2-AP并进行富集检测。

GC-TOF-MS是传统GC-MS的替代升级，适合于复杂基质的全组分分析。通过配备代谢组学产物数据库、SIMICA数据统计学软件等，可开展挥发物组学研究，因此更适于2-AP的相关机制分析，如2-AP生成前体及产物的分析和鉴定等，不适合单纯建立2-AP的定量方法。

2.5 GC×GC-TOF-MS

GC×GC-TOF-MS在GC-TOF-MS的基础上，利用强极性与非极性正交组合的二维色谱柱[16]，采用程序升温对挥发物进行分离，可以提高仪器分辨率与峰容量，同时扫描全谱范围离子，提高仪器的检测通量，特别适合于进行植物相关调控机制分析。

近年来，随着2-AP研究的不断深入，研究人员也逐渐转向2-AP的形成机制研究，从机理层面为香米的呈香机制提供支撑。6-甲基-5-氧代-2,3,4,5-四氢吡啶（6M5OTP），2-乙酰吡咯，吡咯和 1-吡咯啉等化合物与 2-AP的产生密切相关。Daygon等[17]采用GC×GC-TOF-MS从代谢组学角度进行香米的呈香机理研究，结果显示6-甲基-5-氧代-2,3,4,5-四羟基吡啶（6M5OTP）是和 2-AP具有相似香味的同分异构体，该结果也通过GC-TOF-MS检测6M5OTP的标准品得到了验证。全基因组关联分析表明，所有化合物的产生与FGR基因存在关联性，为2-AP的产生及香气累积途径提供了新的见解。

因此，随着GC-TOF-MS和GC×GC-TOF-MS应用于2-AP机制研究的不断深入，2-AP的形成及反应过程将逐步明确，对于提升大米品质具有重要意义。

2.6 GC-O-MS

GC-O-MS是将仪器检测和嗅觉分析相结合进行挥发物分析的技术。在实验过程中，GC将试样组分分离，研究人员通过嗅探口对闻到的气味进行描述并记录，进而获得被测化合物的气味特征。

大米品种及生长区域的不同导致不同的大米具有不同的香气类型。Yang等[18]采用 GC-O-MS分析了六种风味明显不同的大米样品（巴斯马蒂、茉莉、两个韩国粳稻品种、黑米和一种非香米）的香气组成。经过培训的评估人员对米饭样品中36种挥发物进行了描述，结果显示 25种挥发物具有中等或更高的强度（气味强度≥3），被认为是主要的气味活性化合物。随后通过GC-O测定了25种挥发物的气味阈值，结果显示，2-AP的气味阈值最低（0.02 ng/L），其次是 11种醛类（0.09～3.1 ng/L）、愈创木酚（1.5 ng/L）和 1-辛烯-3-醇（2.7 ng/L）。根据气味阈值和气味活性值（Odor Activity Value，OAV），评估了每种主要气味活性化合物的重要性，显示2-AP、己醛、（E）-2-壬醛、辛醛、庚醛和壬醛的OAV占每种大米香气OAV的相对比例在97%以上，并且可以作为区分六种风味大米的标志物。相比 GC-MS等分析仪器，GC-O能够识别出和基质组分共流出的气味组分，可以更加直观地描述气味特征，对于鉴别特殊大米中未知的香气活性成分具有重要意义。

基于GC的仪器方法对小分子低沸点的2-AP有较大的优势，但需要与高温蒸馏或高温萃取等样品前处理方法相结合。2-AP本身具有热不稳定性，在高温条件下可由糖与氨基酸发生美拉德反应而生成。因此，采用 GC相关的分析方法可能会因前处理过程中 2-AP的损失或继续生成而影响结果的准确性。

2.7 HPLC-MS/MS

与 GC分离分析相比，高效液相色谱不需要温度较高的前处理过程，因此对待测物的沸点、热稳定性等要求较低，对 2-AP的检测结果更准确。Jost等[19]采用HPLC-MS/MS建立了大米和小麦面包中2-AP的分析方法。以pH 7.4的磷酸缓冲液为提取剂进行超声提取，以邻苯二胺为衍生试剂进行衍生，生成稳定性较好的2-乙酰基-1-吡咯啉喹喔啉（2-APQ）衍生物，通过加入2-APQ-d4同位素内标进行2-AP的定量。方法的检测限和定量限分别为0.26 μg/kg和0.79 μg/kg，检测的11个巴斯马蒂米样品中2-AP含量为41～356 μg/kg。该方法唯一的不足是衍生化反应需要在避光条件下反应24 h。有研究表明，2-AP在面包烘烤过程中可由鸟氨酸和磷酸三糖磷酸形成[20]，目前未见大米加工过程中形成 2-AP的报导，而以上HPLC-MS/MS法中的样品提取只需要在室温条件下进行，2-AP不会因发生降解而损失，避免了由此引起的测定结果不准确的问题，因此非常适合对面包中2-AP的精确定量。

但是，从目前来看，GC相关技术由于前处理简单，且可同时分析大米中其他化合物包括2-AP等，仍然是分析 2-AP的主流技术。而 HPLCMS/MS由于检测结果更加准确，对于食品加工过程中产生的2-AP的定量分析有重要意义。

3 2-AP形成机制

近年来，关于大米中2-AP的形成机制研究一直在进行中。然而，对于2-AP的形成时期问题，即2-AP是在高温蒸煮过程中，通过氨基酸和碳水化合物发生美拉德反应形成，还是在大米原料即水稻生长过程中形成，一直存在争议。另外，关于 2-AP形成的控制基因和生成前体研究也取得了一些进展。

3.1 形成时期

有研究表明，日本早抽穗品种“宫古里”在籽粒发育过程中，2-AP的含量在抽穗后4或5周达到峰值，然后在7或8周迅速下降至最大值的20%；对于晚抽穗品种“Hieri”中，2-AP浓度在抽穗后4周时达到峰值，然后在8周时逐渐降低到最大值的 40%[21]。因此，大米中的 2-AP可在水稻生长阶段形成。Yoshihashi[22]等研究结果表明，香米考马道里105样品中的2-AP在烹饪中不会形成。此外，2-AP的含量会随着大米储存时间的延长而减少，在储存8个月后，2-AP的含量降至初始含量的7%[23]，该研究表明，2-AP不会在大米储藏过程中形成。因此，2-AP应在水稻生长过程中形成，且在烹饪和储藏过程中不会形成。

另外，研究表明非香米中也含有2-AP，只是含量较香米低[24]。同时，不同的大米品种具有不同的感官特性，表明除2-AP之外的挥发物也在贡献米饭的香味[25]。因此，2-AP不应该是区分香米和非香米的唯一标准。我国水稻品种众多，研究我国大米样品中 2-AP的含量和形成规律对于提升我国大米品质具有重要意义。

3.2 控制基因

大米香气的形成一般由多个基因控制，近年来学者们一直致力于大米香气控制基因的挖掘，为高品质水稻育种提供依据。Lorieux等[26]研究了控制大米香气形成的基因，包括一个主基因和两个QTL标记。结果显示，8号染色体上的几个片段与2-AP形成的主基因即甜菜碱醛脱氢酶（Betaine Aldehyde Dehydrogenase，BADH2）密切相关。

随后，各国研究人员就 BADH2基因展开研究，其中，Bradbury等[27]认为非芳香水稻品种含有BADH2基因，可产生功能性BADH2酶，而芳香水稻品种含有突变 BADH2基因，因此产生非功能性酶，进而产生更多的2-AP。Mathure等[24]研究表明，2-AP的合成与BADH2基因相关，非巴斯马蒂香米的2-AP含量要高于巴斯马蒂香米；在巴斯马蒂香米中，2-AP的含量与1-十四烯和吲哚呈正相关。潘阳阳等[28]研究了 2-AP代谢通路在水稻籽粒发育过程中的变化，以美香占2号香稻和黄华占非香稻为对象，结果表明，BADH2基因的表达水平在两种水稻生长周期内发生了变化，只有美香占 2号水稻具有合成2-AP 的物质基础，多胺降解途径和谷氨酸-脯氨酸转化通路同时有助于2-AP的积累。

尽管如此，BADH2基因并不是控制大米中2-AP形成的唯一基因，且不同品种的控制基因可能存在差异，关于2-AP形成的控制基因研究仍在进行中。

3.3 形成前体

在研究2-AP控制基因的基础上，研究人员继续对2-AP形成的前体进行了探索，主要基于水稻的愈伤组织和同位素示踪实验来进行。Yoshihashi等[29]采用同位素示踪法进行 2-AP的前体研究，15N脯氨酸、15N甘氨酸和脯氨酸-1-13C的示踪实验结果表明2-乙酰-1-吡咯啉的氮源是脯氨酸，而2-AP的碳源不是脯氨酸，且2-AP是在水稻生长阶段形成。此外，Huang等[30]研究了泰农71和泰农72两种香稻中2-AP生物合成的机制，通过愈伤组织研究发现，这两个品种中 δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶，包括 δ1-焦-5-羧酸合成酶（P5CS）和鸟氨酸氨基转移酶（OAT）的活性显著增加，且P5CS1和P5CS2基因的表达水平显著高于普通水稻，用15N标记的谷氨酸进行示踪实验的结果表明，2-乙酰-1-吡咯啉的氮源来自谷氨酸。以上研究就2-乙酰-1-吡咯啉的氮源来源不一致，可能由于仅有有限的同位素标记物用于模拟实验，关于氮源来源是谷氨酸还是脯氨酸、两者均有或还有更多其他来源，结论还需要进一步验证。

此外，Poonlaphdecha等[31]采用水稻愈伤组织对2-AP的合成前体进行了研究，通过在愈伤组织中添加[U-13C]葡萄糖、乙酸钠（1,2-13C2）和辛酸钠（1,2,3,4-13C4），结果表明这些化合物可能是2-AP乙酰基的供体，且1-吡咯啉是水稻合成2-AP的限制因素。

当前，关于2-AP形成的前体研究主要是以愈伤组织开展模拟实验，能不能反应稻谷生长阶段2-AP的实际合成情况还有待进一步探讨。同时，在模拟实验中，仅采用几种同位素标记化合物用于前体研究，对于深入明确2-AP的前体具有很大的局限性，未来有必要基于高分辨质谱进行前体的广泛筛选和验证。

4 结论和展望

开展大米中2-AP精准检测方法的研究，对于明确呈香机理、提升大米品质、及促进进出口贸易都具有重要意义。本文综述了各种前处理技术的优缺点，SPME技术正在成为2-AP提取的主流技术。GC、GC-MS、GC-O-MS等技术由于配置比较低、受基质干扰比较大等问题，在重现性和灵敏度方面还有待进一步提高，对于2-AP的精准定量还有一定的局限性。GC-MS/MS的灵敏度更高，甚至可以实现单粒米水平2-AP的定量分析，可使大米等复杂基质中 2-AP的定量结果更加准确。而新型基于衍生化反应的HPLC-MS/MS分析方法的应用，可有效解决采用 GC-MS分析检测时 2-AP在高温前处理过程中损失或新生成的问题，应成为2-AP精准检测的首选方法。

由于 HPLC-MS/MS技术并不是挥发物研究的主流方法，在推广和实际应用中不如 GC-MS普遍，因此未来的研究方向仍要进一步围绕大米中 2-AP的高效提取方法及精准定量仪器定量方法展开。2-AP的形成时期和控制基因已明晰，但形成前体和路径仍需进一步研究确定，结合GC-TOF-MS、GC×GC-TOF-MS等技术将进一步促进2-AP的形成机制研究。