仿生皮肤电化学传感器的构建及其对鸡蛋过敏原卵清蛋白的检测

刘 兵，曹瀚文，蒋栋磊

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023）

在过去几十年间，虽然食品安全的重视程度不断提高，但食品安全事件却依然层出不穷[1]。食物过敏是人体对食品中的抗原物质产生的、由免疫系统介导的不良反应，可分为4种类型：IgE介导的I型超敏反应、II型毒性超敏反应、III型免疫复合物超敏反应和T细胞介导的迟发性过敏反应[2]，其中IgE介导的食物过敏发病快，易触发，是更常见的类型[3-4]。目前，食物过敏的发病率正逐年上升，且呈现出工业化地区人口的发病率高于其他地区、儿童发病率普遍高于成人的特点，约有8%的儿童和5%的成人对食物有过敏症状，部分地区食品过敏患者的比例已高达10%[5]。已被确定含有过敏原的食品高达170余种且因地理或个体因素而有差异，但就种类而言，日常生活中常见的食物过敏原主要有鸡蛋、牛奶、花生、坚果、鱼虾、贝类、小麦和大豆8种[6]。对于与食物过敏紧密相关的公众来说，难以避免摄入含有过敏原的食物[7]，并且目前暂无有效的、标准化的食品过敏疾病的根治手段，尽量避免食用过敏原仍然是保护过敏人群健康的唯一途径[8]，这就突出了过敏原检测技术的重要地位。

常规的过敏原检测方法有：1）免疫学检测技术，例如酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析等[9-10]。尽管基于免疫的检测方法灵敏度和效率高，但需要高度纯化和稳定的蛋白样品，同时操作复杂、检测时间长、重复性差等缺陷限制了其应用[11]，因此，该类方法并非快速检测食物过敏原的最佳选择。2）分析生物学检测方法，例如聚合酶链式反应、环介导等温扩增技术等[12-13]。此类方法检测的目标物主要是特定的DNA片段，而非特定的致敏蛋白质。3）色谱检测方法，例如高效液相色谱、液相色谱-串联质谱等[14]。由于其高效、灵敏度高、选择性好等优点，至今仍在传统检测方法中占据主要地位，但对实验室的高要求（昂贵笨重的设备）限制了其在即时、现场检测领域的应用。

作为一项多学科交叉的技术，电化学生物传感技术因其具有响应时间快、高灵敏度、高选择性等突出特点，已然成为食物过敏原检测的研究前沿和热点[15]。将生物元件固定在电极表面可以识别目标物体，并通过将生物元件的识别信号转换成数字电信号触发化学反应[16]，然后对检测样品进行定量或半定量分析。更为重要的是，电化学检测技术能够满足现场化、简便化、实时监测的需求，很好地弥补了传统检测方法的缺陷。根据固定在电极表面的生物识别分子的不同，电化学生物传感器可分为免疫传感器、核酸传感器和细胞传感器，其中细胞传感器可以提供更全面、更复杂的信息（如凋亡、生长因子分泌、蛋白质合成等）。许多研究也表明可将肥大细胞作为识别元件，通过不同的固定方式固定在不同电极表面进行过敏原的检测[17-20]。但如若能够实现细胞在三维空间的排布，便可以更加真实地反应细胞形态和细胞间的相互作用，模拟过敏原进入人体后的真实反应，从而达到仿生的水平。生物3D打印技术为这一想法提供了合适的选择。生物3D打印特指操纵活细胞打印活性三维结构的过程，即载细胞打印，也可称为细胞打印[21]。将细胞作为原料混合水凝胶制备成生物墨水进行3D打印，不仅可以精确分配负载细胞的生物材料从而用于复杂三维功能活组织或人工器官的构建，还可以借助细胞这一有趣的生物识别元件打印组织结构，实现三维组织检测和真实仿生传感，从而拓宽仿生传感器的应用范围。

因此，本研究通过导电水凝胶包裹细胞配制成生物墨水，利用生物3D打印技术，旨在实现新一代仿生皮肤传感器的开发，可用于鸡蛋过敏原卵清蛋白的快速检测。本实验结果有望为食物过敏原的检测和评价提供新思路，为进一步开发微组织传感器提供新的策略和理论研究，为实现传感检测机理从细胞水平向组织层面的转变提供一定指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

30%、60%、90%接枝率的甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA） 苏州永沁泉智能设备公司；大鼠嗜碱性白血病（RBL-2H3）细胞、皮肤组织成纤维细胞 中国科学院细胞库（中国上海）。

卵清蛋白、卵清蛋白标准品 美国Sigma-Aldrich公司；聚吡咯（polypyrrole，PPy） 南京先锋纳米科技有限公司；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素 美国Gibco实验室；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS） 碧云天生物科技有限公司（中国上海）；实验所用其他试剂均为分析级。

1.2 仪器与设备

PalmSens4电化学工作站 荷兰PalmSens公司；EFL-8601光固化打印机 苏州永沁泉智能设备公司；LSM 800共聚焦显微镜 德国Carl Zeiss公司；Pharos G2扫描电子显微镜 荷兰飞纳公司；SpectraMax M2e多功能酶标仪 美国分子仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 生物墨水的制备

用于构建仿生皮肤微组织的3D打印生物墨水采用导电水凝胶包裹细胞的形式进行制备。

GelMA导电水凝胶的配制：将1 g GelMA、25 mg光引发剂、5 mg光吸收剂、10 mL PBS，均放置于15 mL棕色离心管中；在50 ℃条件下水浴加热30 min直至完全溶解。溶液经0.22 μm无菌微孔膜过滤到一个新的棕色小瓶中，得到水凝胶前驱液。将一定浓度PPy加入水凝胶前驱液中，超声15 min，制备得到导电水凝胶。

最后将消化后的细胞悬浮液接种到上述GelMA导电水凝胶中制备成生物墨水。

1.3.2 生物墨水的表征及优化

1.3.2.1 流变测试

将凝胶前驱液放在流变仪的中心，选用直径25 mm的压板，板间距为1 mm，在扫描60 s时，固化光线照射。应变1%，角速率5 rad/s，辐照光源405 nm，30 mW/cm2，30 s；测试温度（25±1）℃，时间300 s。

1.3.2.2 PPy浓度优化

对不同PPy掺杂量的水凝胶通过电化学手段差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）进行优化。DPV在以下条件下进行：初始电位-0.2 V；最终电位0.5 V；扫描速率30 mV/s；脉冲电位25 mV；脉冲时间0.10 s；脉搏周期500 ms。

1.3.2.3 打印参数的确定

打印参数如下：基层层数为80；印刷层高度为100 μm；光强为15 mW/cm2；基底曝光时间为15 s；层片曝光时间为12 s；z轴移动速率为20 mm/min；剥离距离为3 mm；剥皮速率为25 mm/min；脱皮恢复速率为200 mm/min；印刷料槽温度为32 ℃。

1.3.3 三维多层皮肤组织模型构建

模拟人体皮肤组织的尺寸和结构，采用三维建模软件3D Bulider设计体外多层皮肤组织模型。首先，皮肤模型由不同细胞在不同组织结构构成，致密的上层结构充当皮肤的表皮层，包含成纤维细胞。网格状的双层结构充当皮肤的皮下组织，包含肥大细胞。为了结合电化学传感平台，皮肤模型设计为可与工作电极区域面积相匹配的尺寸。模型的总尺寸为（7.48×4.84×1.8） mm3，表皮层高度为0.6 mm，皮下组织的高度为1.2 mm，孔径440 μm。

1.3.4 生物3D打印制备皮肤模型

仿生皮肤模型的构建工作主要有以下3 个方面：仿生皮肤建模、打印材料合成、工艺参数优化。简单来说，仿生皮肤结构通过基于DLP的3D打印机制造，特定设计程序遵循以下步骤，并以STL文件保存，打印是通过重复的过程，将图像投射到水凝胶中，然后抬高z轴。打印过程：首先，2种类型生物墨水的细胞（RBL和皮肤组织成纤维细胞）在同一个细胞密度1×106cells/mL，分别均匀混合在生物墨水中。一旦上层完成，就会有一个停顿，使用另一个含有生物墨水的容器（RBL-2H3），在空间上排布打印槽内装载的不同细胞以产生信号级联，然后完成打印过程。

1.3.5 仿生皮肤电化学传感系统的建立

将制备的含有细胞的生物墨水置于光固化3D打印机的打印槽中。导入建模文件并根据调试后的打印参数对皮肤模型进行切片和打印，打印工作时间为9 min，可同时打印数十个传感元件。然后以生物打印皮肤组织为识别元件，采用柔性叉指电极作为传感接口承载仿生皮肤模型，相比较于传统丝网印刷电极，该柔性电极具有较大的工作电极区域且能与皮肤组织较好地匹配。在暴露的工作电极区域覆盖仿生皮肤结构后，连接PalmSens4便携式电化学工作站，基于皮肤模型的电化学传感器已被制备。

1.3.6 电化学传感系统的表征

接通PalmSens4电化学工作站，采用循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）、DPV对仿生皮肤传感的电化学行为测试。CV在以下条件进行：初始电位-0.3 V；最终电位0.6 V；扫描速率100 mV/s。DPV条件：初始电位-0.2 V；最终电位0.5 V；扫描速率100 mV/s；脉冲电位25 mV；脉冲时间0.10 s。

电化学测试均在室温中进行，采用Ps trace模拟软件进行分析，电解液为含有3.0 mmol/L铁氰化钾电解液。

1.3.7 鸡蛋过敏原卵清蛋白的电化学检测

首先将打印好的皮肤结构用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）冲洗3 次以去除未交联的水凝胶。然后，精准放置皮肤结构于电极上，滴入卵清蛋白引诱RBL细胞脱粒（37 ℃孵育30 min）。在0.1～106Hz频率范围内，利用电化学阻抗法测定不同浓度卵清蛋白的阻抗图谱。电化学检测实验均在室温下进行。

1.3.8 电化学传感器的特异性、重现性及稳定性实验

为了评估该传感器的特异性、重复性及稳定性，采用制备的传感器检测含有一些共存的物种，将传感器对卵清蛋白的响应信号与其他共存物种的信号进行比较，以确定仿生皮肤微组织电化学传感器的特异性。选取每组3 个、共5 组仿生界面，在37 ℃、RPMI 1640培养基条件下分别存储0、3、6、9、12 h后检测峰值电流。

1.4 数据处理

实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析和Origin 8.0进行作图，每组实验均设置3 次以上平行，数据表示为。差异显著水平采用t检验，P＜0.05，差异显著，P＜0.01，差异极显著。

2 结果与分析

2.1 传感器的结构和工作原理

图1 仿生皮肤电化学传感器的构建过程Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of the bionic skin electrochemical sensor

引入生物3D打印技术可升级改造传统的凝胶包裹细胞方法[22]。模拟食物过敏靶器官或组织，通过调整皮肤模型的尺寸和结构，利用生物3D打印技术制备仿生皮肤结构。在使用免疫细胞（肥大细胞）的基础上，添加成纤维细胞，共同构建皮肤组织，从关注结构成形的“形似”，过渡到注重生物功能形成的“神似”。内因：肥大细胞与成纤维细胞的相互作用较重要，成纤维细胞可支持肥大细胞成熟表型；外因：单纯细胞系模型虽然简单易用，但单层分散的细胞缺乏细胞与细胞间、细胞与细胞基质间的相互作用，且在体外培养中容易丢失细胞的异质性和内在特征，从而无法真正反映机体内复杂的三维环境及重现组织功能[23]。如图1所示，为了提高传感器的灵敏度，在GelMA凝胶的基础上，使用PPy制备导电水凝胶。导电生物墨水用于高通量打印皮肤模型结构，并将其固定在叉指工作电极区。皮肤结构用作识别元件识别卵清蛋白，使肥大细胞脱粒，然后利用电化学工作站将化学信号转换为电信号（如电流、阻抗等）。

2.2 导电水凝胶的制备及其表征优化

2.2.1 GelMA水凝胶固化过程中的模量分析

图2 30%、60%、90%接枝率的GelMA流变测试Fig. 2 Rheological test of GelMA with graft rates of 30%, 60% and 90%

为了成功构建仿生皮肤微组织，需要选择合适接枝率的水凝胶用于3D打印，已有研究证实生物墨水的流变行为对打印性能起至关重要的作用[24]，特别是水凝胶的黏弹性，低黏度的水凝胶会导致凝胶前驱液扩散，从而降低形状的保真度和力学性能[25]。此外，封装在低黏度生物墨水中的细胞有快速沉积倾向，在印刷材料中无法做到均匀分布。也就是说，凝胶的刚度和弹性已被证明对3D仿生组织中的细胞行为有深远影响，而正确地调整这些力学性能对培养的成功至关重要[26]。选用10 g/100 mL不同接枝率（30%、60%、90%）的GelMA，进行凝胶固化分析。如图2所示，刚开始，前驱液的损耗模量（G’’）远大于储能模量（G’）时，材料主要发生黏性形变，呈液态。在1 min后开启405 nm光源照射后，储能模量逐渐增大，官能团单体聚合，开始交联，黏度突增。在90 s时储能模量和损耗模量趋于稳定，且储能模量均高于损耗模量，流体表现为固体。考虑到后续皮肤模型的构建，在外界光照条件下可以更好地实现凝胶化，有利于微组织的成形，筛选60%、90%接枝率的GelMA水凝胶进行下一步的优化及后续的实验。

2.2.2 GelMA水凝胶的电化学性能分析及PPy浓度优化

图3 不同接枝率GelMA的电化学性能表征Fig. 3 Electrochemical properties of GelMA with different grafting rates

水凝胶的电化学性能对传感器的检测性能尤为重要，因此利用稳定的三电极电化学系统对不同接枝率的GelMA进行电化学性能分析。如图3A、B所示，不同接枝率的GelMA均表现了微弱的氧化还原峰，且从DPV图看，凝胶具有可忽略的导电能力，导电性GelMA 30＞GelMA 60＞GelMA 90，GelMA 60相比较于GelMA 90，导电性能有了明显的增加。因此，结合2.2.1节水凝胶的固化模量，在保证微组织成形的基础上同时兼顾传感器电化学检测的灵敏性，最终选取60%接枝率的GelMA 用于后续导电水凝胶的制备。

为了提高传感器的灵敏度，需要在60%接枝率的GelMA中添加导电材料以增强其导电性，但导电材料的添加浓度严重影响着电化学传感器的分析性能。为确定PPy材料的最佳添加量，采用电化学方法（DPV）进行优化。如图3C所示，PPy质量浓度在2.0～3.5 mg/mL，电流峰值从7.87 μA增加到21.18 μA，表明PPy具有显著的电信号放大功能，掺杂较高质量浓度的PPy能有效提高生物墨水的导电性，工作电极表面的活性位点数量增加，加速了电子转移。但3.5 mg/mL的PPy/GelMA会在一定程度上干扰皮肤模型的打印，会造成同批次之间样品的形状形成较大的残次。因此，确定PPy质量浓度3.0 mg/mL适用于之后的生物墨水制备工作。

2.2.3 PPy/GelMA导电凝胶及生物墨水的微观形态

图4 GelMA、PPy、GelMA/PPy和生物墨水电镜图Fig. 4 SEM images of GelMA hydrogel, polypyrrole,GelMA/PPy, and bio-ink

采用扫描电镜、冷冻电镜分别对单纯GelMA、PPy和两者复合物的微观结构进行表征。图4A显示了GelMA凝胶的微观表观形态，大小不一的孔洞状结构共同组成凝胶形态，且凝胶孔径内表面较为光滑。图4B显示，由于微纳米孔的存在使水凝胶具备三维多孔网络结构，有利于与外界的气质交换和保持溶液的进出通道，且这些孔增加了凝胶的表面积并允许其捕获更多的水，使材料对所施加的电荷快速反应。由图4C所示，PPy的大小约为600 nm，由此制备的导电水凝胶提供了良好的物理组合，有助于皮肤模型的构建。图4D显示了掺杂PPy的GelMA，GelMA/PPy内表面被PPy成功覆盖，表面呈现出PPy所具有的粗糙状态，这可能是因为形成的GelMA/PPy比GelMA具有更高机械强度，PPy形成互穿网络嵌入水凝胶中而提高导电能力[27]。

图4E可以看到，这种独特的多孔网络结构使水凝胶柔软而湿润，并且水凝胶内部的大量水可以为细胞提供生物相容且适宜的环境[28]。如图4F所示，由于使用的GelMA分子含有利于细胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，可以看到细胞被黏附在明胶材料上，有助于细胞在培养中保持较好的功能性。有序的孔隙结构保证了内部的营养物质传输及细胞代谢废物的排除。

2.3 生物3D打印仿生皮肤结构及其表征

图5 皮肤模型建模图和生物3D打印实际产品及其液体交换能力测试Fig. 5 Modeling diagram of the skin model, 3D bioprinted products and liquid exchange capacity test

图5A显示，该仿生皮肤结构可分为2 个部分，致密的上层结构（600 μm）可充当皮肤的表皮层，有利于保护伤口免受外界的机械冲击和压力。相比之下，下层的皮下组织（1.2 mm）设计成悬臂梁结构，管状的网络的真皮结构在液面下培养时促进营养物质的输送和代谢产物排出，从而促进新生血管形成[29-30]。在显微镜下进一步观察微通道为440 μm的微观结构，确认与设计一致。

为了进一步确认下层的互联结构，使用激光扫描共聚焦显微镜观察了悬臂梁结构，如图5B所示，三维悬臂梁结构以高保真度清晰可见。将打印完成的皮肤组织用培养基轻轻冲洗3 遍后加入含有10% 胎牛血清的DMEM培养基浸没培养30 min后，皮肤组织变成红色，说明该组织具有优异的液体交换能力（图5C）。

2.4 仿生皮肤传感器的电化学表征

图6 传感器的电化学表征Fig. 6 Electrochemical characterization of the sensor

采用CV和DPV对仿生皮肤传感器的不同修饰步骤进行电化学表征，如图6所示，CV图中插图显示了在裸叉指电极表面上的典型和可逆的氧化还原峰。当工作电极上放置纯GelMA打印的皮肤结构时，氧化还原峰值变小，这说明此结构对电化学过程形成了屏障，阻止氧化还原探针进入电极表面。随着PPy的添加，氧化还原峰值有一定程度的恢复，显示出导电水凝胶具备一定的导电性。当测量仿生皮肤组织的电信号时，可以看到峰值电流明显下降，细胞的添加影响皮肤本身的电阻，该结果可能是由细胞黏附引起，进而阻碍电子传递，导致电子传输速率变低，增加了电极的电阻。类似的信号变化如图6B所示，没有添加导电的材料的峰值电流为5.61 μA，在添加了PPy纳米复合材料之后，峰值明显增加，为19.40 μA，这表明填加了PPy纳米材料可以显著提高该皮肤组织的导电性能，有利于提高灵敏度。当添加细胞后，峰值电流降低，Ip值大约为14.94 μA。当细胞固定在以GelMA为主，添加了PPy纳米材料的生物墨水打印的仿生皮肤时，可以为此提供生物相容、三维微纳米环境，电化学表征结果表明，该皮肤模型具备优异的电化学响应。

2.5 仿生皮肤电化学传感器对卵清蛋白的检测

如图7A所示，随着卵清蛋白质量浓度的上升（0.5～2.5 μg/mL），工作电极表面的阻抗值（Ret）迅速增加，Nyqusit曲线半圆的直径增大，这说明较低质量浓度卵清蛋白刺激细胞发生脱颗粒，释放胞内各种介质如组胺、类胰蛋白酶和β-己糖胺酶等，这些因子会阻碍电子转移，从而导致Ret增加。图7B显示了通过实验获得的卵清蛋白的标准曲线。可以看到电化学阻抗Ret对卵清蛋白的质量浓度良好响应，线性范围为0.5～2.5 μg/mL，线性方程为y=4.45C+14.24，相关系数为0.998，根据公式检出限=3s/k计算出检出限为0.19 μg/mL，其中s表示空白样品标准偏差（k=3），k表示卵清蛋白的标准曲线的斜率。以上实验结果证明在一定的质量浓度范围内，所构建的电化学细胞传感器能够准确灵敏地检测卵清蛋白质量浓度。

图7 不同质量浓度卵清蛋白的电化学检测Fig. 7 Electrochemical detection of different concentrations of ovalbumin

2.6 仿生皮肤传感器的特异性、重复性及稳定性

表1 1.0 μg/mL卵清蛋白分别在1.0 μg/mL干扰物下对传感器的相对响应Table 1 Response of the sensor to 1.0 μg/mL ovalbumin in the presence of interferences (1.0 μg/mL)

特异性是构建传感器的关键指标。以花生过敏原Ara h 1、醇溶蛋白、大豆球蛋白、虾原肌球蛋白和牛血清白蛋白为干扰物，分别比较电化学传感器的响应来评价细胞传感器的特异性。如表1所示，相同浓度物种的阻抗比（Ret样品/Ret对照）无明显变化，说明本研究所构建的电化学细胞传感器具有良好的特异性。

图8 电化学传感器的稳定性及重复性Fig. 8 Stability and repeatability of the electrochemical sensor

稳定性和重复性是评价细胞传感器性能的重要指标。但细胞保存的条件较为苛刻，难以在外部环境长期保持良好的细胞活性，这对细胞传感器的稳定性是一个挑战。而利用生物3D打印技术可以达到仿生微组织的快速、规模化生产，在检测前短时间内即可实现仿生微组织传感器的构建，从而达到快速、现场检测的要求，这就缩短了细胞传感器需要保存的时间，降低了对货架期的要求。因此，选取5 组仿生界面贮存在37 ℃、RPMI 1640培养基条件下，时间间隔为3 h检测峰值电流。如图8所示，峰值电流在18.8～19.2 μA范围内（低于5%），说明该传感器具有良好的重复性和稳定性。

3 结 论

利用生物3D打印技术进行含有表皮层和皮下组织的仿生皮肤结构的制备，成功开发一种仿生皮肤传感界面，并将其应用于电化学传感器的构建。使用3D Builder软件对仿生皮肤结构进行三维建模，致密上层结构充当表皮层，管状的网格结构充当皮下组织。模型的总尺寸为（7.48×4.84×1.8）mm3，表皮层高度为0.6 mm，皮下组织的高度为1.2 mm，孔径440 μm。同时选取3.0 mg/mL PPy修饰GelMA以提高仿生皮肤导电性，结合叉指电极组建传感器对鸡蛋卵清蛋白进行电化学分析。检测结果表明，在卵清蛋白质量浓度在0.5～2.5 μg/mL范围内，Ret与蛋白质量浓度呈良好的线性关系，验证了该仿生皮肤传感器检测卵清蛋白的可行性。使用3D生物打印技术可以缩短细胞传感器的构建时间，降低制备成本，可满足样品现场快速检测的需求。