罗非鱼加工副产物不同部位硫酸软骨素的制备、理化性质及结构表征

左格格，钟赛意,2,3,*，陈 菁，徐敏凤，陈建平，李 瑞，刘晓菲，宋兵兵，贾学静

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋生物制品工程实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518063；3.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034）

硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，由交替的D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，GlcA）和N-乙酰氨基半乳糖（N-acetyl-D-galactosamine，GalNAc）连接的二糖单位组成[1]。根据GlcA和GalNAc不同位置上连接硫酸基团的数量和种类不同，CS主要分为A型、C型、D型和E型。CS主要从动物软骨中获取，比如猪软骨[2]、牛软骨[3]、鸡龙骨[4]、鲨鱼[5]、鱿鱼软骨[6]。相比之下，由于陆地动物存在疯牛病，猪霍乱和口蹄疫等疾病[7]，海洋来源的CS安全性更高。然而，商品化CS主要是鲨鱼来源，其资源珍稀且价格昂贵，因此寻找经济且安全性高的CS新来源受到学者们的广泛关注。

罗非鱼（Oreochromis mossambicus）又称非洲鲫鱼，属于热带性硬骨鱼类，具有生长快、肉质好、产量高、繁殖力强等特点。2020年我国淡水养殖罗非鱼总产量约为165万 t[8]，主要以冷冻罗非鱼片作为我国的出口水产品，在加工过程中会产生大量的副产物（包括鱼头、鱼尾、鱼骨、鱼鳞、鱼皮和内脏等）[9]。这些废料富含CS[10]、胶原蛋白[11]、鱼油[12]等高值物质，具有多种生物活性，但通常会被丢弃或不加区分的加工成饲料等低值产品，使得大量的资源未得到充分的开发利用。目前，国内外还未确定罗非鱼头骨、脊骨、鱼鳍和鱼尾中CS的含量和类型。

本研究以罗非鱼副产物不同部位为原料制备CS，并对其理化性质和精细结构进行分析，评估罗非鱼下脚料是否可以作为商品化CS的一个潜在来源，旨在为罗非鱼副产物的高值化开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼副产物购自广东省湛江市遂溪县恒诚生物科技有限公司，于-20 ℃冷冻保藏。

硫酸软骨素钠标准品 中国食品药品检定研究院；CS（CS-A、CS-C） 上海麦克林生化科技有限公司；Savinase 16L 美国Sigma公司；2709碱性蛋白酶南京庞博生物工程有限公司；D-甘露糖（D-mannose，Man）、GlcA、D-半乳糖醛酸（D-galacturonic acid，GalA）、D-无水葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）、D-木糖（D-xylose，Xyl）、阿拉伯糖（L-arabinose，Ara）、氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）、氨基半乳糖（D-galactosamine，GalN）、GlcNAc 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200LC高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent公司；UV-2550紫外-可见分光光度计、AUW120型电子分析天平日本岛津公司；Tensor-27傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；旋转蒸发仪 日本EYELA公司；FD8508真空冷冻干燥机 韩国ilshin公司；Varioskan Flas全自动酶标仪、Sorval Lynx6000高速落地离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；HL-6数显恒温水浴锅 常州奥华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 罗非鱼副产物不同部位CS的制备

取新鲜的罗非鱼副产物按鱼头、鱼鳍、鱼脊骨、鱼尾切分为4 个部位，分别进行蒸煮除去多余的肌肉等杂质，用乙醇浸泡过夜，湿骨放入65 ℃烘箱烘干，然后粉碎成粉末，骨粉在-80 ℃贮存备用。取10 g不同部位的骨粉，按料液比1∶25（g/mL）加入50 mmol/L Na2CO3溶液，调节pH 7.0，再加200 μL Savinase 16L，55 ℃水浴搅拌4 h，100 ℃灭酶10 min。冷却到室温，加入终质量浓度5.4 mg/mL的2709碱性蛋白酶，50 ℃反应2 h，100 ℃灭酶10 min。冷却到4 ℃、8 000 r/min离心20 min，收集上清液。按滤液质量加入5%三氯乙酸静置3 h，离心收集上清液，3 倍乙醇醇沉4 ℃过夜。离心收集沉淀，溶于20 mmol/L Na2SO4溶液，缓慢滴加质量浓度6 g/100 mL氯化十六烷基吡啶溶液直至不再有沉淀析出。离心收集沉淀复溶于2 mol/L NaCl溶液-乙醇（100∶15，V/V）溶液，然后3 倍乙醇醇沉4 ℃过夜。离心得到沉淀，用蒸馏水溶解透析24 h，浓缩，冷冻干燥，得到不同部位的CS。提取率计算公式如下：

式中：m1为样品质量/g；m2为原料质量/g。

1.3.2 罗非鱼副产物不同部位CS理化性质测定

CS含量测定：采用硫酸-咔唑法[13]，以硫酸软骨素钠为标准品；蛋白质含量测定：采用Folin-酚法[14]，以牛血清白蛋白为标准品；GlcA含量测定：采用硫酸-咔唑法[15]，以GlcA为标准品；GlcN含量测定：采用Elson-Morgan法[16]，以GlcN为标准品；硫酸基含量测定：采用BaCl2-明胶比浊法[17]，以硫酸钾为标准品。

1.3.3 罗非鱼副产物不同部位CS结构表征

1.3.3.1 紫外光谱扫描

将CS标准品和4 个部位制备的CS用蒸馏水配成0.25 mg/mL的溶液，用紫外-可见分光光度计在190～400 nm范围内进行光谱扫描，以吸光度为纵坐标、波长为横坐标绘制光谱图。

1.3.3.2 醋酸纤维膜电泳

称4 个部位制备的CS、CS-A、CS-C各5 mg，用蒸馏水配成质量浓度为5 mg/mL的溶液。以pH 3.0的0.1 mol/L吡啶-0.47 mol/L甲酸混合溶液，作为电泳缓冲液，在7 mA电流下电泳20 min。结束后用阿利新蓝溶液染色（2%醋酸溶液作为溶剂）15 min，再用2%醋酸溶液脱色10 min。

1.3.3.3 傅里叶红外光谱扫描

采用硫化钾压片法，称取硫酸软骨素钠和4 个部位CS各1 mg，与100 mg干燥后的溴化钾在玛瑙研钵中充分研磨混匀，压成透明薄片于400～4 000 cm-1进行红外光谱扫描。

1.3.3.4 分子质量测定

称取5 mg 4 个部位CS样品，溶于1 mL超纯水中，经0.45 μm水系滤膜过滤后采用高效凝胶过滤色谱测定样品的相对分子质量。色谱条件：色谱柱UltrahydrogelTMLinear（7.8 mm×300 mm），流动相0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃。

1.3.3.5 单糖组成测定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）-柱前衍生化HPLC法[18]，以CS-A、CS-C为对照对4 个部位制备的CS进行单糖组成分析。色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 6.74）-乙腈（83∶17，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：245 nm，紫外检测器；进样体积：10 μL。

1.3.3.6 二糖组成测定

根据《中国药典》规定[19]，采用强阴离子交换-HPLC法对样品进行二糖组成分析。色谱条件：Hypersil SAX柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温40 ℃；检测波长232 nm；流动相：A为水（pH 3.5），B为2 mol/L NaCl溶液（pH 3.5）；进样量20 μL；洗脱程序：0～4 min，100% A、0% B；4～45 min，100%～50% A、0%～50% B。

1.4 统计学处理

2 结果与分析

2.1 理化性质分析

表1 罗非鱼不同部位CS的理化性质比较Table 1 Comparison of physicochemical properties of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

如表1所示，罗非鱼副产物不同部位CS的理化性质具有差异性。4 个部位CS的总糖含量和糖醛酸含量没有显著差异。鱼头和鱼尾的CS含量、GlcN含量、硫酸基含量没有显著差异。其中鱼头部位的CS质量分数和提取率最高，分别达到（90.37±1.77）%和1.02%，可能是CS主要存在于软骨中；鱼尾、鱼鳍和鱼脊骨CS质量分数分别为（83.33±17.88）%、（59.76±1.22）%和（52.01±3.15）%。GlcN质量分数依次为鱼尾、鱼头、鱼鳍、鱼脊骨，最高达（19.28±1.62）%，最低为（2.49±0.62）%。4 个部位CS的硫酸基质量分数依次为鱼头（22.89±0.11）%、鱼尾（22.72±2.92）%、鱼鳍（18.34±0.42）%、鱼脊骨（12.56±0.28）%，差异明显。4 个部位CS的蛋白质含量较低，说明三氯乙酸除蛋白效果较好。

2.2 结构表征

2.2.1 紫外波长扫描光谱

如图1所示，罗非鱼副产物不同部位CS和CS标准品都在190～200 nm之间具有糖类特征吸收峰，且峰形均较窄、尖锐、无其他杂峰。其中鱼头和鱼脊骨CS在260 nm波长处有微弱的吸收峰，说明含有少量的核酸。4 个部位CS在280 nm波长处都没有蛋白质的吸收峰[20]，表明纯度较好。

图1 罗非鱼不同部位CS的紫外光谱Fig. 1 UV spectra of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

2.2.2 醋酸纤维膜电泳

图2 罗非鱼不同部位CS的电泳图Fig. 2 Acetate cellulose electrophoresis patterns of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia and chondroitin sulfate standard

根据不同类型CS的迁移率不同，从而对其进行鉴别[21]。如图2所示，CS-C和CS-A的结构相似，但CS-C的硫酸化程度和电荷密度较高，因此迁移率表现比CS-A快。罗非鱼副产物不同部位CS的电泳条带单一、较窄，说明不含其他糖胺聚糖且电荷均一。4 个样品的迁移率与CS标准品接近，均含有不同比例的CS-A和CS-C。

2.2.3 傅里叶变化红外光谱分析

图3 罗非鱼不同部位CS的红外光谱图Fig. 3 Infrared spectra of chondroitin sulfate in four body parts of tilapia

表2 罗非鱼不同部位CS的红外光谱分析Table 2 Infrared spectral analysis of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

如图3所示，4 个部位CS在4 000～1 300 cm-1范围内无明显区别，而在1 300～400 cm-1指纹区域内有细微差别。鱼头和鱼尾CS红外图谱在指纹区与CS-C标准品相近，而鱼脊骨和鱼鳍CS与CS-A标准品相似。如表2所示，4 个样品CS相同之处在于：在3 400 cm-1附近处由O—H伸缩振动引起，说明存在氢键，且峰形均较宽；2 900 cm-1附近有糖类物质的特征吸收峰[22]；1 640 cm-1和1 550 cm-1附近有—NHCOCH3—的C＝O伸缩振动和N—H变角振动，属于酰胺I吸收带[23]；1 420 cm-1附近存在羧基的C＝O伸缩振动；1 370 cm-1附近有以GlcA形式存在的O—H变角振动[24]；1 240 cm-1附近存在硫酸基；1 040 cm-1和920 cm-1附近存在吡喃糖伸缩振动，说明4 个部位CS都存在糖环、乙酰氨基、硫酸基、羟基和羧基等官能团，具有CS的基本结构[25]。

2.2.4 分子质量分析

图4 罗非鱼不同部位CS分子质量分布图Fig. 4 Molecular mass analysis of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia

表3 罗非鱼不同部位CS分子质量分析Table 3 Molecular mass analysis of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

如图4所示，罗非鱼下脚料不同部位CS的出峰时间和CS标准品一致，其中倒峰是溶剂NaNO3的峰，相比较而言样品CS的峰形对称性较差且有杂峰，表明样品中含有小分子杂质[26]。将保留时间代入不同分子质量葡聚糖所得的线性回归方程，结果如表3所示。CS的相对分子质量一般在5 000～50 000范围内[27]，罗非鱼副产物不同部位CS的分子质量属于CS类。比较发现，鲨鱼来源CS-C标准品的mn、mw和mz均显著高于牛软骨来源的CS-A标准品。鱼脊骨和鱼鳍CS的mn较接近，分别为18 402和19 481，接近但均低于CS-A。而鱼头和鱼尾CS的mn介于CS-A和CS-C之间，分别为51 422和76 371。鱼头CS的mw和mz都高于其他3 个部位CS，显著低于CS-C标准品。分散系数是（mw/mn）用于衡量分子质量的分布广度，鱼尾CS的分散系数最低，说明其分子质量分布较窄，其次是鱼头CS为3.77，均比鲨鱼来源CS-C的分散系数低。据文献报道[28]，来自牛气管相对分子质量为10 000～15 000，猪软骨相对分子质量为9 000～13 000，鸡软骨相对分子质量为7 800～12 800，安康鱼骨相对分子质量为48 680，鳕鱼骨相对分子质量为18 120，鲑鱼骨相对分子质量为20 070，表明不同来源CS的分子质量有明显差异，且软骨鱼类和硬骨鱼类分子质量之间也有区别，而罗非鱼不同部位CS的分子质量更接近硬骨鱼类。

2.2.5 单糖组成分析

图5 HPLC法对罗非鱼不同部位CS单糖组成分析Fig. 5 HPLC chromatograms showing the monosaccharide composition of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia

表4 罗非鱼4 个部位的单糖组成分析Table 4 Analysis of monosaccharide composition of chondroitin sulfate from different body parts of tilapia

采用PMP衍生法，以CS-A和CS-C为参照，对罗非鱼副产物不同部位CS进行单糖组成测定，色谱图如图5所示，分析结果如表4所示。4 个部位CS和标准品的单糖种类相似，主要含有GlcA、Glc、GalN，以及少量的GlcN、GalA、GlcNA、Gal、Xyl、Ara。鱼头CS不含有GalA，鱼尾CS含有少量的Man。不同部位CS在13 min都在出现了与标准品出峰时间不匹配的未知峰，可能是未降解的寡糖片段[29]，这与分子质量分析结果一致。

2.2.6 二糖组成分析

图6 罗非鱼不同部位CS二糖组成图Fig. 6 Chromatograms showing the disaccharide composition of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

表5 罗非鱼不同部位CS二糖组成分析Table 5 Disaccharide composition of chondroitin sulfate in different body parts of tilapia

将罗非鱼副产物不同部位CS用硫酸软骨素酶降解，利用强阴离子交换-HPLC对酶解产物进行分析，色谱图如图6所示。CS-A和CS-C的硫酸基团位置和数量不同，CS-A中Δdi4S比Δdi6S多，而CSC相反[30]。如表5所示，4 个部位CS均不含三硫酸化二糖。其中鱼头CS不含有二硫化二糖，Δdi6S（46.10%）比Δdi4S（41.01%）含量高，属于CS-C。鱼尾也是CS-C，与鱼头不同的是还含有0.68%二硫酸二糖（Δdi2,6S）。鲨鱼CS主要由单硫酸二糖Δdi6S（40.8%）和Δdi4S（34.9%）组成[31]，从罗非鱼头和鱼尾提取的CS与鲨鱼CS的二糖组成相似。Δdi4,6S（1.21%）只在鱼脊骨CS中存在，除此之外还包含Δdi2,4S（0.46%），但Δdi4S（71.86%）含量最高，主要为CS-A。鱼鳍CS与鱼脊骨CS二糖组成相似，但不含有Δdi4,6S而是含有0.41%的Δdi2,6S二硫化二糖，主要为CS-A。根据Δdi4S和Δdi6S物质的量比（4S/6S）可得出相同结论，与红外光谱扫描的结果一致。硫酸化程度和电荷密度呈正比[32]，4 个部位CS的电荷密度0.96～0.81不等，其中鱼鳍CS电荷密度最高，硫酸根含量最高；其次是鱼脊骨CS，最低的是鱼尾CS，这与醋酸纤维膜电泳结果相同。

3 结 论

利用Savinase 16L和2709碱性蛋白酶双酶酶解从罗非鱼下脚料中提取CS，对其理化性质分析发现不同部位CS的纯度从90.37%～52.01%不等，糖醛酸含量相近，GlcN含量差别明显。醋酸纤维膜电泳、单糖组成和红外光谱进一步分析表明4 个部位制备的样品均为CS，但类型不同。通过二糖组成对其进行鉴定，鱼头和鱼尾CS硫酸化主要在GalNAc的C6位，但鱼尾含有0.68%的CS-D，此类型在软骨鱼中存在较多；鱼脊骨和鱼鳍CS硫酸化主要在GalNAc的C4位，区别是鱼脊骨含有1.21%的CS-E。陆地来源中提取的CS基本不存在二硫化二糖，因此从罗非鱼副产物CS分离出的二硫化二糖可以作为鉴定CS来源的标志。

罗非鱼头和鱼尾的Δdi6S含量比鲨鱼高，分别为46.01%和41.44%，4S/6S为0.89和0.92，与鲨鱼的二糖组成相似。因此，无论从资源、经济还是安全性的角度，罗非鱼副产物代替鲨鱼作为CS新来源的优势显而易见。本研究结果可为硬骨鱼类CS的开发利用提供理论依据，使得加工生产中的废料变成高附价值产品成为可能。

CS具有抗血栓、抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗过敏和免疫调节等活性，也会对生物材料的性能产生影响[33]。CS的活性和功能与其特定的结构和性质有密切的关系，会受到硫酸化的位点和程度以及分子质量影响。因此，本研究从罗非鱼加工副产物不同部位制备的CS可以为其构效关系、活性研究以及产品开发提供理论参考[34]。