熊果酸对大鼠海绵体神经损伤性勃起功能障碍的治疗作用与机制探讨

陈云臣 刘洋 杨勇 孙东翀

阴茎勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是指在性刺激情况下成年男性的阴茎难以正常或维持勃起,且无法完成满意的性交,病程＞6 个月［1］。原发性神经元组织损伤之后,一系列的代谢失调,包括缺血、兴奋性毒素、钙和线粒体失调,最终导致炎症介导的继发性神经元损伤。海绵体神经损伤后内皮细胞和海绵体平滑肌发生凋亡,一氧化氮合酶阳性神经细胞受到损伤,纤维增生性细胞因子上调,进而出现海绵体平滑肌纤维化［2］。由于对阴茎海绵体神经的损伤,根治性前列腺切除术(radical prostatectomy,RP)术后导致的ED 发生率较高［3］,虽然探索中各种治疗方法较多,但目前疗效明确的方法并不多。熊果酸(ursolic acid,UA)是一种具有多种药用特性的中药提取物,在植物界分布较广泛,如山楂、栀子、山茱萸,车前等中药中。研究发现,熊果酸具有镇静、抗炎、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖,以及明显的抗氧化功能等多种生物学效应［4,5］。熊果酸在脑、脊髓损伤及神经退化性疾病的治疗方面有神经保护作用［6］,提示其有可能对RP 术后因海绵体神经损伤导致的ED 发挥潜在的治疗作用。因此,本研究以神经损伤性ED 大鼠为研究对象,制备阴茎海绵体神经损伤模型,观察熊果酸对大鼠勃起功能恢复的影响,初步探讨其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 18 只购于北京科宇有限公司［许可证号：SCXK(京)2018-0010］健康无病原体 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,8 周龄,体重250～300 g。所有大鼠适应性喂养1 周后,随机分为假手术对照组、模型对照组(双侧海绵体神经损伤)和治疗组(双侧海绵体神经损伤+熊果酸治疗),每组6 只。

1.2 方法

1.2.1 主要实验器材及试剂 熊果酸(上海爱必信生物科技有限公司)；MP150 多导电生理仪(美国Biopac公司)；稳压稳流定时电泳仪(北京六一仪器厂)；Centrifuge 5417R 低温离心机(美国Eppendorf 公司)；显微手术器械(上海医疗器械厂)；α-SMA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和N-NOS 兔多克隆抗体(美国Abcam 公司)。全部实验操作均在解放军总医院动物实验室开展,参照解放军总医院动物使用指南执行。

1.2.2 神经损伤模型建立 参照王飞翔等［7］提供的方法建立大鼠神经性ED 模型。所有SD 大鼠使用3%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg 腹腔注射进行麻醉。在下腹部行正中切口,前列腺背外侧找到两侧盆神经节,距盆神经节发出3～5 mm 处用小弯血管钳分别钳夹双测海绵体神经,血管钳扣合至最后一个咬齿,钳夹海绵体神经各2 min。

1.2.3 治疗方法 熊果酸溶于1% 二甲基亚砜(DMSO)-磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,治疗组大鼠给予熊果酸50 mg/kg 灌胃,1 次/d；假手术对照组和模型对照组则给予同样体积的1% DMSO 在PBS 中作为载体对照,1 次/d。上述治疗自海绵体神经损伤模型建立后第1 天开始,持续4 周。

1.2.4 大鼠阴茎海绵体压力测定及颈动脉测压 实验开始4 周后,三组大鼠使用3%戊巴比妥钠30 mg/kg进行腹腔注射麻醉。打开大鼠腹腔,找到盆神经节和海绵体神经,放置刺激电极,测定海绵体内压(intracavernous pressure,ICP),刺激持续时间设置为60 s,设置参数：电流强度为1.5 mA、刺激频率为20 Hz。游离穿刺颈总动脉,测定平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)。通过比较ICPmax/MAP 评估阴茎勃起功能。测压结束后深度麻醉处死SD 大鼠,留取阴茎组织,供后续研究使用。

1.2.5 Masson's 三色染色 应用4%多聚甲醛固定阴茎组织,石蜡包埋并制备4 μm 厚度切片。进行脱蜡、水化后遵照Masson's 试剂盒进行染色。在光镜下观察阴茎海绵体,胶原组织被染为绿色,平滑肌组织被染为红色。使用Image-Pro plus 软件对海绵体平滑肌/胶原比例进行分析。

1.2.6 免疫组织化学染色 海绵体测压后深度麻醉处死大鼠,取阴茎中段组织,多聚甲醛固定阴茎组织,石蜡包埋,制备4 μm 厚度切片；进行脱蜡、水化；抗原修复及封闭后滴加一抗(α-SMA)37℃孵育1 h；滴加反应增强液,在室温下孵育20 min,滴加酶标二抗,在室温下孵育20 min；二氨基联苯胺氧化氢(DAB-H2O2)显色,自来水充分漂洗,复染、脱水、透明,封片；光镜下观察。

1.2.7 Western blot 检测蛋白表达 使用含有蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液进行裂解阴茎组织,行Western blot 分析。使用BCA 试剂盒检测蛋白浓度,然后将蛋白进行凝胶电泳和电转,用5%脱脂奶粉封闭,并与α-SMA、GAPDH 和nNOS 的一抗孵育过夜。在室温下与二抗孵育后显影拍照,采用Image-Pro Plus 软件进行分析条带。

1.3 观察指标 比较三组大鼠ICPmax、MAP、ICPmax/MAP、平滑肌/胶原比值、平滑肌含量及nNOS、α-SMA 表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ()表示,采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP比较假手术对照组和治疗组ICPmax 和ICPmax/MAP 均明显高于模型对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；三组MAP 比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 三组大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP 比较()

表1 三组大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP 比较()

注：与模型对照组比较,aP＜0.05

2.2 三组大鼠Masson's 三色染色检测平滑肌/胶原比值比较 阴茎海绵体组织石蜡切片行Masson's 三色染色(图1A),利用平滑肌(红色)/胶原(绿色)比值评估阴茎组织间质胶原沉积(图1B)。假手术对照组和治疗组平滑肌/胶原比值均高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1A 阴茎海绵体组织石蜡切片Masson's 三色染色

图1B 三组大鼠平滑肌/胶原比值比较

2.3 三组大鼠免疫组织化学染色平滑肌含量比较 阴茎海绵体组织石蜡切片行免疫组织化学染色(图2A),免疫组织化学染色观察海绵体平滑肌含量(图2B)。假手术对照组和治疗组平滑肌含量高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

图2A 阴茎海绵体组织石蜡切片免疫组织化学染色

图2B 三组大鼠平滑肌含量比较

2.4 三组大鼠Western blot 检测α-SMA 表达比较假手术对照组和治疗组α-SMA 表达高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3。

图3 三组大鼠Western blot 检测α-SMA 表达比较

2.5 三组大鼠Western blot 检测nNOS 表达比较 假手术对照组和治疗组nNOS 的表达均高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见图4。

图4 三组大鼠Western blot 检测nNOS 表达比较

3 讨论

前列腺癌发病率在全球呈显著上升趋势［8］,而RP 是目前治疗局部进展性前列腺癌最常见的方法。但即使在神经保留手术方式出现后,RP 术后ED 发生率仍然很高。根据一项前列腺癌预后研究,在为期5 年的随访中,60%的患者在RP 术后18 个月自我报告有ED［9］。RP 术后的ED 对许多患者及其性伴侣的生活有影响极大,尤其是对于性生活活跃的相对年轻的患者而言更是如此。临床部分外科手术也会引起术后ED。阴茎海绵体神经是副交感神经,沿前列腺后外侧走行并支配阴茎,通过控制流向阴茎海绵体组织的血液调节勃起功能。解剖学上,海绵体神经紧邻前列腺包膜,在前列腺癌根治性切除过程中,极易受到机械性或电、热等损伤,进而引起术后ED［10］。有关RP 术后ED 的实验研究,需要建立可靠的动物模型。本研究通过利用钳夹海绵体神经造成人为神经损伤,模拟RP 术后相关海绵体神经损伤过程［11］,高度类似于临床实际手术操作,重复好,能够满足实验的需求。海绵体神经损伤后对交感神经的拮抗作用减弱,引起阴茎海绵体平滑肌功能障碍,特别是舒张功能,这是海绵体神经损伤术后早期出现ED 的关键原因［12］。然而,在海绵体神经损伤后磷酸二酯酶5 型抑制剂的治疗效果有限［13］,提示还存在着更深层次的原因。有研究结果表明,海绵体神经损伤诱导的ED 可因进行性海绵体纤维化和海绵体去神经支配而逐步进展［14］。

神经元组织损伤后出现一系列代谢失调,包括缺血、兴奋性毒性、钙和线粒体失调,最终导致炎症介导的继发性神经元损伤。因此,在神经保护方法中抗炎治疗是合理的,可为新的神经元生长提供基础。熊果酸具有抗氧化和抗炎作用,其具有改善神经损伤的独特潜力。Zhang 等［15］采用大鼠蛛网膜下腔出血脑损伤模型,观察熊果酸(25 或50 mg/kg)给药48 h 后的作用效果,发现治疗组细胞间粘附分子-1、Toll 样受体4、核因子-κB、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮含量显著降低。这一结果表明,抗炎及细胞凋亡抑制作用是熊果酸具有神经保护作用的重要机制。相关研究［16］评估熊果酸对小鼠脑损伤的影响,发现在脑损伤诱导后24 h 实验后经熊果酸(50～150 mg/kg)干预,可以减少脑水肿和神经功能障碍,显示出明显的神经保护作用。相关研究［17］利用脊髓损伤小鼠模型研究了熊果酸对神经再生的影响,发现熊果酸100 或200 mg/kg,1 次/d,连续治疗6 周后可以促进轴突再生和运动功能的恢复。此外,熊果酸还具有抑制损伤脊髓中IL-6 和TNF-α 等促炎细胞因子生成的作用。Li 等［18］通过小鼠脑缺血的大脑中动脉闭塞模型,研究了熊果酸的神经保护作用,发现熊果酸可使脑梗死面积显著减少,同时使脂质过氧化标记物丙二醛维持在低水平。

海绵体神经损伤后海绵体组织内缺氧,平滑肌细胞凋亡增加,引起组织纤维化,收缩型标记物如α-SMA、肌动蛋白等表达下降［19］。本研究通过检测大鼠ICP 和MAP 发现,模型对照组大鼠ICPmax/MAP明显低于假手术对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。由此说明神经损伤性ED 大鼠模型构建成功。治疗组ICP 高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。表明熊果酸对勃起功能具有改善作用。免疫组织化学及Masson's 三色染色发现治疗组平滑肌/胶原比值高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。由此证明经过熊果酸干预后平滑肌细胞凋亡减少,组织纤维化得到改善。通过Western blot 检测海绵体中α-SMA的表达水平,得到相似的结果,即假手术对照组和治疗组α-SMA 表达高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。由此表明熊果酸使α-SMA 表达水平上升［20］。同时,对三组nNOS 表达水平检测发现,经过熊果酸干预后,治疗组nNOS 表达水平高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

熊果酸保护阴茎海绵体组织的机制与其抗炎作用关系密切。核因子红细胞系2 相关因子2(nuclear factor erythroid derived 2-like 2,Nrf2)能够加强细胞抗氧化作用,是机体抗氧化防御系统中重要的调节因子。相关研究表明,熊果酸可使Nrf2 蛋白核易位增多、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)醌氧化还原酶及血红素氧化酶表达增加,诱导Nrf2 和血红素氧化酶在蛋白和mRNA 水平的核表达相结合,抑制细胞间粘附分子-1、Toll 样受体4、核因子-κB、白细胞介素-1β、TNF-α 等的表达,提示Nrf2 信号通路是熊果酸发挥其潜在作用重要机制［15-17］。熊果酸可能是通过Nrf2信号通路作用影响海绵体神经,使勃起神经损伤后大鼠ICP 明显改善,阴茎海绵体组织nNOS、α-SMA 的表达水平升高,平滑肌调亡减少,进而减轻海绵体纤维化,使大鼠勃起功能得到改善。因此,熊果酸能够通过其抗炎、抗氧化作用改善海绵体神经损伤后大鼠阴茎海绵体平滑肌的氧化损伤和缓解组织纤维化,进而改善阴茎勃起功能,显示熊果酸的潜在治疗作用。

综上所述,熊果酸能够通过抑制阴茎海绵体纤维化有效改善神经性ED 大鼠的阴茎勃起功能,而神经保护作用及抗氧化损伤作用可能是熊果酸对神经损伤性ED 发挥治疗作用的潜在机制。但在本次研究中,主要观察阴茎海绵体组织及其勃起功能的变化,熊果酸对海绵体神经本身的影响尚未涉及,有待于进一步探讨。