茶叶中硒蛋白检测与营养功能研究进展

丁颀 宁弋珍 张菁 谢春生 张宝杰＊

(1.肇庆学院 环境与化学工程学院，广东省肇庆市 526061；2.梧州市茶产业发展服务中心，广西梧州市，3.肇庆学院 农村科技特派员工作站，广东省肇庆市526061；)

1 前言

硒是人类体内必需的微量元素之一，其兼具金属性和非金属性，拥有6种稳定同位素，而且还具有清除生物体内自由基、抗过氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力、排毒等功能，维持机体中适量的硒水平能预防多种疾病，如大骨节、克山病、癌症等，所以硒对人类的生活和健康有着至关重要的作用[1,2]。近年来，研究发现一些典型的硒蛋白，如谷胱甘肽过氧化物酶、甲状腺激素脱碘酶和硫氧还蛋白还原酶，这些典型的硒蛋白都是参与细胞氧化还原调节功能的关键蛋白，也是维持细胞内氧化还原稳态及甲状腺激素代谢平衡的重要参与者[3,4]。发展富硒茶是功能农业的突出代表，开展茶叶中硒蛋白的检测与营养功能的研究具有重要的意义。

2 硒的种类与检测

硒可分为总硒、无机硒和有机硒。无机硒主要以硒单体、硒酸盐和亚硒酸盐的形式存在[5]。其中有机硒主要以硒代氨基酸的形式存在，如硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代半胱氨酸，这些硒代氨基酸不仅能通过活性钠依赖系统被肠道吸收，而且它们与无机硒相比具有更高生物利用度和较低毒性[6]。在有机硒中，γ-谷氨酸-甲基硒代半胱氨酸是比较有效的防癌抗癌有机硒化合物[7]。通常认为人体正常一天补硒标准是摄入50到200μg，所以适当的适时的补硒对身体健康有着十分重要的作用。

检测硒含量的方法主要有荧光分光光度法、紫外分光光度法、氢化物原子荧光光谱法、石墨炉原子吸收光谱法、电感耦合等离子体光谱法、电感耦合等离子体质谱法等[8]。其中氢化物-原子荧光光谱法（HG-AFS）、氢化物发生原子吸收光谱法（HG-ASS）测试准确度高，是目前应用广泛的硒的测定方法。氢化物-荧光光谱法（HG-AFS）是最为广泛运用的硒含量的检测方法，其结果准确度高、操作简便、灵敏度高的特点使其广泛受用，大大提高了食品中检测硒蛋白的效率[9]。近年来，电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）由于具有简单快捷，精度和准确度高的特性，在硒含量的检测中应用越来越广泛。而硒形态的检测方法是对有机硒组分的进一步细化，通常需要结合高效液相色谱预处理的方法进行成分分离[10]。高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法（HPLC-UV-HG-AFS），成本较低，但灵敏度较差[11]。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS），是分析硒形态最便捷、最灵敏也是最常用的检测方法，但不提供未知化合物的结构信息且应用范围较小[12]。高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术（HPLC-ESI-MS），灵敏度高，选择性好，准确度高，能提供未知化合物的结构信息且应用范围广。

富硒茶通常只检测总硒、无机硒和有机硒，硒蛋白的提取需要特殊的方法[13]。富硒茶中同时存在大量的硒蛋白，硒蛋白占总硒含量的60.12%[14]，茶叶中的硒蛋白多为碱溶性，经水浸泡无法溶出而留于茶渣中，占茶渣总量的23.18%之高[15]。而且通过生物转化生产的富硒茶叶，含硒量在0.3-5.0μg/g，但是茶叶中水溶性硒浸出率仅占总硒的10%左右。胡秋辉等人[16]的研究发现茶叶中的有机硒占总硒的80%，这些有机硒主要与蛋白质结合，而硒蛋白占有机硒的79.56%～88.70%，茶叶中的蛋白质含量占茶叶干重的15%-30%。

3 茶叶中典型硒蛋白的功能及检测

3.1 硒代甲基半胱氨酸（SeMeCys）

硒代甲基半胱氨酸是茶叶中硒代氨基酸的主要存在形态，其存在的时期和含量并无规律性，主要由茶树体内硒半胱氨酸甲基转移酶（Selenovysteinemethyltransferase, SMT）决定，能将茶树内具有一定毒害作用的硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸转化为硒代甲基半胱氨酸，并且有效提高茶树茶叶对硒的吸收、富集和耐性[17]。

秦冰等人[18]运用离子色谱-积分脉冲安培检测法（HPAEC-IPAD）对茶叶浸提液中硒代氨基酸进行定性和定量分析，硒代甲基半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的相对标准偏差RSD分别为2.47、3.17和3.77，具有非常好的相关性，其结果也表明这种对硒代氨基酸的分析方法操作简便、准确度高。

3.2 硒代半胱氨酸（selenocysteine，SeC）

SeC被认为是第21种氨基酸，其对应的密码子是UGA，当有特殊识别因子存在时，UGA才指导蛋白质中SeC的合成，否则只作为终止密码[19,20]。SeC位于酶的活性部位，具有催化氧化还原的作用。与其他氨基酸相比，直接膳食摄入的SeC不能直接参与硒蛋白的合成，必须经过复杂的合成机制进行重新合成，才能使Sec参与合成硒蛋白，满足生物体的正常生活需要。所以硒的抗氧化作用主要通过SeC参与构成的硒蛋白来实现。SeC大多处在硒蛋白酶活性位点上，使其具有特异的功能特性，对硒蛋白的生理活性具有重要意义。Fomenko·D·E等[21]研究发现在同源序列中搜索Cys-SeC可以选择性地识别具有催化氧化还原活性残基的蛋白质，不仅可以过滤出非功能性Cys（半胱氨酸），而且过滤出不具有催化氧化还原功能的保守Cys，可以确定大多数已知的使用催化氧化还原活性Cys的家族。Gómez-Jacinto V等人[22]的研究结果表明，可以运用微生物转化法通过富硒小球藻将培养基中亚硝酸盐转化为硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。微生物转化法因成本和技术难度低而应用广泛。何家伟等人[23]发现也可运用化学法将氯丙氨酸和二硒化钠反应生成硒代胱氨酸后于液氨中将硒代胱氨酸还原裂解为硒代半胱氨酸[24]。但该方法需要在超低温及用到活泼金属钠的条件下进行，反应条件苛刻而难以投入大规模的生产中。

丁颖等人[25]设计合成了一种能识别硒醇的荧光探针分子O-hNRSel，其灵敏度高、选择性好，能有效定位到硒蛋白的活性位点，即硒代半胱氨酸，有效提高了活细胞中硒代半胱氨酸的检测效率。Hand D等人[26]运用了紫外处理-氢化物发生原子荧光光谱法检测不同硒浓度下烤烟中以SeC为主的有机硒和无机硒的比例，并以此判断烟草的生长情况。研究发现，当硒浓度为2.2mg/kg～11.1mg/kg处理烟草叶时可检测出硒代半胱氨酸及部分有机硒，适当地促进了烟草的生长及其抗氧化能力；而当硒浓度为22.2mg/kg时仅可检测出无机硒，过量的无机硒将破坏活性氧（ROS）平衡并提高烟草中MDA含量，抑制了烟草的生长及其抗氧化能力。Xia Q等人[27]运用实时荧光定量PCR分析富硒茶树中成熟茶叶和茶树嫩根中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的ATP硫酸化酶（APS）和硒代半胱氨酸甲基转移酶（SMT）的表达水平，发现富硒茶叶中APS和SMT的表达均低于普通茶叶，而嫩根中的APS和SMT均高于普通茶树根几倍，表明茶叶中硒蛋白的存在影响着某些基因的表达水平。

3.3 硒代蛋氨酸（selenomethionine，SeMet）

硒代蛋氨酸可以借助肠道细菌蛋氨酸酶的催化释放硒化物。SeMet是谷物、豆类中主要的硒化物，是动物体内第21个氨基酸，是硒代半胱氨酸（SeC）的主要前体[28]。可以非特异性地替代甲硫氨酸残基并存在于蛋白分子中[29]，SeMet在体内可通过胱硫醚γ裂解酶降解为甲基硒醇，通过甲基化作用后转化为二甲基硒化物或三甲基硒化物，然后通过去甲基化转化为硒化物，最终参与硒蛋白的合成过程。孙协平等人[30]发现SeMet与土壤中氮的吸收转运存在密切关系，农作物对SeMet的吸收主要是依赖于氢离子与NRT1.1B的运输，当土壤中的氮元素与硒等微量元素发生耦合互作时，会产生氮肥，提高了土壤中SeMet的利用效率及作物的产量。

章发盛等人[31]运用了高效液相色谱-原子荧光光谱法对茶叶中硒的赋存形态进行测定，发现在无紫外线消解情况下难以对硒形态进行分离，将该方法进行优化后得出连续进样7次相对标准偏差RSD均小于4%的结果，且硒的回收率在81.47%～119.30%，说明该方法具有较高的准确度，在用纯水浸提法和盐酸提取法进行前处理时都无法检测出峰值，但运用甲醇提取法能测得茶叶样品中含有硒代蛋氨酸6.25μg/L，且硒代蛋氨酸占总硒含量的1.3%，所以该优化后的方法只适用于高硒含量样品，否则难以测出硒代蛋氨酸。

3.4 硒蛋白P（selenoprotein PP1,SePP1）

人体中的硒蛋白P含有366个氨基酸的糖化蛋白，大约三分之二的分子被折叠成包含一个硒代半胱氨酸基的N端结构域，而较小的C端结构域含9个SeC[32]，这使得人体中的硒蛋白P具有运输硒的功能[33]，影响着人体内硒的代谢分布和稳态调节。此外硒蛋白P还具有高效的抗氧化能力，通过表达该硒蛋白可以有效减少细胞对氧化氢攻击的敏感性[34]。Saito Y等人[35]发现纯化后的SeP可以有效促进和支持神经元的存活，比无机硒的效率更高。Shintaro等人[36]通过对C57BL/6J小鼠肝脏中肝细胞因子和肝脏来源的分泌蛋白的观察发现，绿茶提取物能有效减少高脂肪饮食引起的硒蛋白P产生水平的增加，从而间接减少肥胖、高血压、胰岛素反抗等部分会引起全身不良反应发生的情况。在此可看出，茶叶中的硒蛋白P不仅能有效促进人体的神经元活跃，而且能与茶叶中的其他物质反应而不对人体产生过激的作用。

Ying等人[37]在考察单独或联合使用巴西坚果和绿茶提取物（GTE）胶囊补充对靶向生物标记物的影响中发现单独或联合使用GTE的受试者血浆中硒水平及直肠硒蛋白P均呈现上升趋势，表明茶叶有助于提高人体内硒蛋白水平，有效降低结直肠癌发生的概率。

4 结论

富硒茶叶中硒蛋白的种类繁多，对人类的健康有着或好或坏的不同程度的影响，所以仍然需要更多的实验和研究了解清楚硒蛋白的营养功能。硒蛋白在人体内起着不可或缺的重要作用，尽管目前发现了茶叶中硒蛋白具有抗癌症、抗过氧化、增强免疫力、延缓衰老等的营养功能，但随着人们生活水平的不断提高，对硒蛋白的需要也会越来越高，所以继续发现和研究硒蛋白的营养功能具有重要意义，对科学且合理地利用硒蛋白预防、治疗人类疾病具有重要作用。