一氧化氮和茶多酚对肥城桃抗氧化系统的调控作用

肖兴荣，丁芮，宫淑琪，朱树华

(山东农业大学化学与材料科学学院，山东泰安 271018)

抗氧化系统具有保护细胞膜以及各种细胞器免受活性氧损伤的功能[1]，在水果采后贮藏品质保持中发挥着重要作用。

具有活性的一氧化氮(NO)在延长果实的贮藏寿命和保持果实品质方面有积极的作用[2]，可提高果实采后的质量，延长新鲜果品如桃、香蕉等[3,4]的保质期。能抑制呼吸跃变型果实乙烯的产生，降低活性氧的积累，参与果实成熟并显著降低果实在贮藏期间水分的流失[5]。可通过减少活性氧的积累来保护植物细胞免受氧化应激的影响[6]。

茶多酚为多酚类物质，在茶叶中含量约15%～30%，具有良好的抗氧化能力，既能抑制自由基的产生，还能有效清除细胞内过量的自由基[7,8]，且无毒，对人体安全，是天然的食品抗氧化剂[9,10]，可用于各种食品的贮藏保鲜[11,12]。茶多酚有较强和较广的抗菌、抑菌性能[13]，除能清除自由基外，还可以激活自由基清除体系，抑制脂膜的过氧化反应，络合诱导氧化的金属离子来抑制自由基的产生，或激活细胞内抗氧化防御系统[14]。能抑制多酚氧化酶的活性，延缓水果的褐变[15]。

目前，NO可以提高采后果实抗氧化酶活性降低活性氧的累积，抑制乙烯的产生，减少水分流失，保持采后果实品质。茶多酚可以提高抗氧化系统的活性来抑制自由基的产生并消除自由基。因此一氧化氮和茶多酚都可以通过促进果实抗氧化系统延长果实的贮藏时间并保持果实品质。笔者研究并比较了NO和茶多酚处理对桃果实贮藏期间抗氧化系统的调控作用。

1 材料和方法

1.1 试验材料与仪器

莱山蜜(Purnuspersicacv. Laishanmi)于2020年9月采自山东省肥城市，果实生长良好，无病虫害，无机械损伤。试验仪器：紫外可见扫描分光光度计UV-2450型(日本岛津公司)；电子分析天平BS210S型(德国Sartorius公司)；pH计S-3D型(上海精科电器公司)；水浴锅HH-2型(国华电器有限公司)；组织粉碎机All basic S25型(IKA公司)；高速离心机GL-20G-Ⅱ型(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试验设计与方法

试验设3个NO浓度(5、15、30 μmol/L)处理[16]，2个茶多酚浓度(14.2、42.6 mmol/L)处理[17]，对照为蒸馏水处理。

每个处理选取36个桃果实，分别用上述浓度溶液浸泡0.5 h，置于25 ℃下贮藏待测相关指标，每2 d取样测定1次，至10 d。

1.3 指标测定

1.3.1 丙二醛(MDA)含量 称取测待桃果肉10 g，研磨匀浆后，加入25 mL磷酸缓冲液(pH 7.8)浸提10 min，取1 mL样品浸提液，加入7.5 mL Tris-HCl(pH 7.5)、1 mL 0.6 %硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混匀，沸水浴15 min后冷却至室温，经15 000 g离心15 min，取上清液于比色皿中，分别测定450 nm、532 nm和600 nm的吸光度，计算：

MDA含量=6.45(A532-A600)-0.56A450，单位表示为μmol/g FW(鲜重)。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性 称取待测桃果肉10 g，加25 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)匀浆，在4 ℃以15 000 g离心15 min，取上清液备用。取3 mL 50 mmol/L磷酸反应液(pH 7.8，含13 mmol/L甲硫氨酸、63 μmol/L氮蓝四唑(NBT)、1.3 μmol/L核黄素和10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，在暗处加入30 μL酶液，25 ℃下用4 000 lx荧光灯管照光，出现颜色变化后，测定560 nm的吸光度。以未加酶液的反应体系为空白对照，以单位时间内抑制NBT光还原率达50 %的酶量为1个酶活性单位(U)。

1.3.3 过氧化氢酶(CAT)活性 取10 g果肉，研磨匀浆后，加入25 mL磷酸缓冲液(pH 7.8)浸提，15 000 g离心15 min。取0.2 mL上清液，加入3 mL磷酸缓冲液、0.1 mL的1 %过氧化氢溶液，立即摇匀，并转入比色皿中，测定240 nm的吸光度变化。从加入H2O2起计时，每15 s读数1次。以未加酶液的反应体系为空白对照，以单位时间内抑制NBT光还原率达50 %的酶量为1个酶活性单位(U)。

1.3.4 过氧化物酶(POD)活性 采用联苯胺法测定POD活性[18]。取10 g果肉，研磨匀浆后，加入25 mL磷酸缓冲液(pH 7.8)浸提10 min，15 000 g离心15 min。取上清液(粗酶液)1 mL，加入2 mL联苯胺乙酸-乙酸钠溶液30 ℃水浴5 min。加入1 mL 0.3 % H2O2，立即摇匀，并转入比色皿中，测定580 nm的吸光度变化。从加入H2O2起计时，每15 s读数1次。以单位时间单位质量内吸变化度变化0.01为一个酶活单位(U)，单位表示为U/mg FW。

1.3.5 赖氨酰氧化酶(LOX)活性 参照吴敏[19]等的方法测定。取10 g果肉，加入25 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)，在4 ℃匀浆，15 000 g离心15 min，取上清液作为酶粗提液。取0.2 mL粗酶液，加入25 μL 50 mmol/L亚油酸钠，2.775 mL 100 mmol/L乙酸缓冲液(pH 5.5)，30 ℃反应，测定234 nm吸光度变化。加酶液15 s后开始计时，记录1 min内在234 nm下吸光度的变化，以1 min内吸光度升高的数值定义为1个酶活单位(U)，LOX活性以U/g FW表示。

1.4 统计分析

各指标测定重复三次，采用SPSS软件进行显著性分析，差异有统计学意义(P<0.05)，单因素方差分析和Tukey检验。

2 结果与分析

2.1 NO和茶多酚处理对肥城桃MDA含量的影响

如表1，3个浓度NO处理的肥城桃在贮藏10 d期间，MDA含量整体呈上升趋势。对照也是上升趋势。贮藏至6 d时，处理的小于对照，说明NO处理抑制了果实MDA的产生。贮藏8～10 d时，反而处理的大于对照的。

表1 NO和茶多酚处理对肥城桃MDA含量的影响 μmol/g FW

茶多酚2个浓度(14.2、42.6 mmol/L)处理的桃果实贮藏10 d期间，除贮藏2 d时处理的大于对照的，贮藏4～10 d时，处理的小于对照的，说明茶多酚抑制了果实MDA的产生。

但NO 3个浓度处理之间、茶多酚2个浓度处理之间、NO与茶多酚处理之间分别对果实中MDA的抑制作用，互有显著性差异，但未体现出规律。从贮藏10 d时的效果看，NO处理的MDA值大，效果差，茶多酚处理的MDA值小，效果好。

2.2 NO和茶多酚处理对肥城桃SOD活性的影响

如表2，NO处理的肥城桃贮藏的10 d中，SOD活性呈先升后降趋势，但都显著高于对照。说明NO处理有提高桃果中SOD活性的作用。

表2 NO和茶多酚处理对肥城桃SOD活性的影响 U/g FW

茶多酚处理的桃果实在贮藏的10 d中，SOD活性的变化规律同NO，也说明茶多酚处理有提高桃果中SOD活性的作用。

但3个NO浓度处理之间、2个茶多酚浓度处理之间，分别对果实中SOD的活性增强作用，互有显著性差异，未体现出规律。

2.3 NO和茶多酚处理对肥城桃CAT活性的影响

如表3，NO处理的肥城桃在贮藏的10 d期间，CAT活性是先上升最后降低趋势，对照的变化规律亦然，且处理的都显著高于对照的。贮藏8 d时，以5 μmol/L处理果实的CAT活性(212.84 U/g FW)最高，是对照(64.76 U/g FW)的330%。表明NO处理比对照增加了CAT活性。

表3 NO和茶多酚处理对肥城桃CAT活性的影响 U/g FW

茶多酚处理的肥城桃CAT活性变化：14.2 mmol/L处理的一直升高，贮藏10 d时达到峰值(196.78 U/g FW)，是对照的388%。42.6 mmol/L处理的CAT活性是先上升最后降低趋势，且处理的都显著高于对照的，表明茶多酚处理比对照增加了CAT活性。

2.4 NO和茶多酚处理对肥城桃POD活性的影响

如表4，NO处理的肥城桃贮藏的10 d期间，5 μmol/L NO处理桃果的POD活性一直呈上升趋势，贮藏10 d时至峰值(5.68 U/mg FW)，是对照(4.38 U/mg FW)的130 %。而15、30 μmol /L NO 2个浓度处理果实的POD活性呈先上升后下降趋势。NO 3个浓度处理果实的POD活性在贮藏至10 d时均显著低于对照。

表4 NO和茶多酚处理对肥城桃POD活性的影响 U/mg FW

茶多酚2个浓度处理桃果贮藏10 d期间，POD活性均呈先升后降趋势，对照亦然。贮藏至6 d时，14.2 mmol/L处理的桃果的POD活性达到峰值(5.89 U/mg FW)，是对照(5.60 U/mg FW)的105 %。

2.5 NO和茶多酚对桃果实LOX活性的影响

如表5，NO处理的肥城桃贮藏10 d期间，LOX活性呈先升后降趋势。贮藏6 d时，5 μmol/L NO处理的桃果实LOX活性达峰值(4.89 U/mg FW)，是对照(3.65 U/mg FW)的134 %。

表5 NO和茶多酚处理对肥城桃LOX活性的影响 U/g FW

茶多酚处理的肥城桃贮藏10 d期间，LOX活性也呈先升后降趋势。贮藏至6 d时，14.2 mmol/L茶多酚处理桃果的LOX活性达峰值(3.87 U/mg FW)，是对照(3.70 U/mg FW)的105 %，是42.6 mmol/L茶多酚处理(3.55 U/mg FW)的109 %。

3 小结与讨论

目前桃果实贮藏保鲜中常用低温贮藏保鲜技术和气调贮藏保鲜技术。低温冷藏使桃果实的失水率增高,易发生皱缩现象,贮藏效果差,贮藏期短[20]。气调贮藏可以减少乙烯对果蔬的刺激，减少果蔬体内物质消耗，降低腐烂率等，成为研究的热潮[21]。NO广泛存在于生物体中，不仅影响着生物的生长发育等一系列生理过程，而且在信号转导过程中发挥着关键作用[22]，NO处理具有效果明显、省时省力、节约成本等优点[23]，但目前NO作用的分子机制存在着太多的未知数[24]。茶多酚作为一种自然提取物，副作用小，原料丰富，并且具有良好的活性，然而茶多酚本身不具备较好的稳定性，容易氧化，在保鲜过程中产生的自由基和氧化物不断蓄积，达到一定数量后会抵消其本身的活性[25]。

本研究证明，NO处理比对照不处理能降低贮藏期肥城桃的MDA含量，贮藏前6 d抑制桃果POD活性，贮藏0～4 d期间抑制LOX活性，明显提高贮藏后期SOD活性，延长了贮藏时间。茶多酚的高效抗氧化活性，能明显减缓细胞膜脂质的过氧化程度，抑制桃果贮藏期MDA的产生，提高SOD的活性和后期CAT的活性，抑制POD和LOX的活性。维持桃果实细胞膜的完整性，延缓果实的衰老，有利于果实的贮藏[26-28]。整体看，30 μmol/L NO处理和14.2 mmol/L茶多酚处理效果为好。综合NO和茶多酚对桃果实抗氧化系统的影响情况，以及考虑试验造价和操作过程，NO处理比茶多酚处理的应用更具优势。