中等强度运动训练对慢性心衰大鼠心肌细胞线粒体呼吸链复合物活性的影响

★舒华 余银翎 杨炼 郭磊磊 付蓉 许滔 李杰凤 孙安会（.贵州中医药大学第二附属医院 贵阳 50000；.贵州中医药大学 贵阳 50000；.开阳县中西医结合医院 贵阳 50000）

慢性心力衰竭是心血管疾病的终末阶段，延缓心力衰竭的进展是临床治疗的重要目标之一。线粒体作为机体能量的主要产生场所，也影响心肌能量代谢，线粒体产能的能力即线粒体的呼吸功能，其影响细胞的供能，对维持机体功能具有重要意义。研究表明，心衰时线粒体呼吸功能下降，线粒体呼吸链复合酶的蛋白表达明显降低［1］。因此，从改善线粒体呼吸功能角度治疗心力衰竭，是值得深入研究的课题。

目前以运动为主的心脏康复是延缓心衰进展、促进心功能改善的重要手段。合理的运动训练能够促进心肌能量代谢［2］，而线粒体功能与心肌能量代谢水平直接相关。相关研究证实，不同的训练强度可以不同程度地改善大鼠心肌线粒体的呼吸链功能［2］，对慢性心衰的作用机制为临床制定合理的运动处方提供了理论依据。而中等强度训练是目前运用最广泛，也是被各大康复指南所推荐的运动强度。据此，本实验通过阿霉素诱导建立CHF大鼠模型，探讨中等强度运动训练对CHF大鼠心肌细胞线粒体呼吸链复合物活性影响机制，为中等强度运动训练改善心衰患者心功能提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验资料

1.1.1 实验动物 60只8周龄健康雄性SD大鼠，体重约（220±10）g，均购自长沙天勤生物公司（许可证号：SCXK＜湘＞2019-0014），于贵州中医药大学基础重点实验室实验中心饲养，在自然光照环境中，自由进食，适应性饲养1周，温度（25±3）℃，相对湿度（55±10）%。

1.1.2 主要药物与试剂 盐酸阿霉素（北京索莱宝公司，货号D8740）；AMPK抑制剂Compound C（MCE，货号HY-13418A）；盐酸曲美他嗪片（施维雅＜天津＞制药有限公司）；AMPK抑制剂Compound C（Med Chem Express公司，货号HY-13418A）；线粒体呼吸链COXⅠ活性检测试剂盒（Cayman chemical公司，货号0542767）；线粒体呼吸链COXⅡ活性检测试剂盒（Cayman chemical公司，货号0537875）；线粒体呼吸链COXⅢ活性检测试剂盒（Cayman chemical公司，货号0542663）；线粒体呼吸链COXⅣ活性检测试剂盒（Cayman chemical公司，货号0537955）。

1.1.3 主要仪器 动物跑台（江苏赛昂斯，型号SA101B）；超声仪（日本Fujifilm，型号Visual Sonics Vevo 2100）；微量移液器（德国Gilson公司，型号CN251-01）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号H1650R）；精密PH计（雷磁公司，型号E-201-C）；普通冰箱（荣事达公司，型号BCD-245F）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 随机选择60只SD大鼠（雄性）中的10只作为正常对照组，其余50只大鼠均在相同条件下用阿霉素诱导法造模。在造模过程中死亡14只，将造模成功的36只大鼠随机数字表法分为4组，即CHF模型组（模型对照组，n=8）、曲美他嗪组（阳性对照组，n=9）、中等强度运动训练组（运动组，n=8）和运动+AMPK抑制剂组（n=8）。

1.2.2 造模方法 按文献造模方法并结合预实验结果复制CHF大鼠模型［3-4］，即将阿霉素溶解于生理盐水中，制备成2 mg/mL溶液。大鼠腹腔注射1.5 mg/kg，每周2次，连续6周，累积剂量为18 mg/kg。正常对照组腹腔注射等量生理盐水。

1.2.3 处理方法 于第6周末开始，将成功建模的大鼠随机分组后，阳性对照组给予曲美他嗪10 mg/（kg·d），每周5次，连续8周；正常对照组和模型对照组灌胃等量0.9% NaCl；运动组和运动+AMPK抑制剂组进行中等强度运动训练。具体方法如下：每天在跑台上进行5 min适应性运动（坡度0°，速度5 m/min）后，将大鼠调整到5°、20 m/min（凭Bedford［5］经验公式，相当于60%最大摄氧量），第1天运动时长20 min，每天增加10 min，第3天及之后维持运动40 min，强度不变，每周5天，连续8周；运动+AMPK抑制剂组，在运动同时腹腔注射AMPK抑制剂（CompoundC）［6］，剂量为20 mg/kg，每周2次，连续8周。

1.3 样本采集及指标检测

1.3.1 超声心动图检测 于第6周干预后由同一超声科医师分别对空白组与模型组大鼠用彩色多普勒超声心动图测量左室短轴缩短分数（LVFS）和左室射血分数（LVEF）。每只大鼠测试3个心动周期，最后取平均值，以评价模型质量。

1.3.2 线粒体呼吸链复合物活性检测 提取大鼠心肌线粒体，检测线粒体呼吸链复合物I-Ⅳ活性，具体步骤严格按相应试剂盒的说明书执行，采用比色法测定活性。分别将10 μL线粒体蛋白加到酶复合物Ⅰ-IV反应缓冲液1 mL中，随后各组加入相应工作液启动反应。线粒体呼吸链复合物I-IV的数值分别以每分钟每毫克蛋白所消耗的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、二氯酚靛酚（DCP）、还原型泛醌（CoQH2）以及还原型细胞色素C（CytoC）的量来表示。

1.4 统计学方法

所得数据均采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，表示为均值±标准差（±s）。配对比较采用t检验；多组比较符合正态分布和方差齐性，采用单因素方差分析；否则使用具有多个独立样本的非参数检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心脏彩超的比较

造模6周后，与正常对照组比较，慢性心力衰竭模型组LVFS、LVEF水平均有显著下降（P＜0.05)。提示CHF模型制作成功。见表1、图1。

表1 正常对照组与慢性心力衰竭模型组心脏参数比较（±s） %

表1 正常对照组与慢性心力衰竭模型组心脏参数比较（±s） %

注：与正常对照组比较，*P＜0.05。

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图1 正常对照组与慢性心力衰竭模型组心脏彩超图

2.2 各组线粒体呼吸链CoxⅠ、Ⅱ活性比较

与正常对照组比较，其他各组线粒体呼吸链CoxⅠ、Ⅱ（ComplexⅠ、Ⅱ）活性均降低（P＜0.05）；与模型对照组比较，各干预组ComplexⅠ、Ⅱ活性均升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，运动组ComplexⅠ、Ⅱ活性增加（P＜0.05），运动+AMPK抑制剂组ComplexⅠ、Ⅱ活性下降明显（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠线粒体呼吸链COXⅠ、Ⅱ活性对比（±s） nmol/（min·mg）

表2 各组大鼠线粒体呼吸链COXⅠ、Ⅱ活性对比（±s） nmol/（min·mg）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05。

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2.3 各组线粒体呼吸链CoxⅢ、Ⅳ活性比较

与正常对照组比较，其他各组心肌细胞线粒体呼吸链COXⅢ、Ⅳ（ComplexⅢ、Ⅳ）活性均减少（P＜0.05）；与模型对照组比较，各干预组ComplexⅢ、Ⅳ活性均升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，运动组ComplexⅢ、Ⅳ活性增加（P＜0.05），运动+AMPK抑制剂组ComplexⅢ、Ⅳ活性降低（P＜0.05）；与运动组比较，运动+AMPK抑制剂组ComplexⅢ、Ⅳ活性降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠线粒体呼吸链COXⅠⅡ、Ⅳ活性对比（±s） nmol/（min·mg）

表3 各组大鼠线粒体呼吸链COXⅠⅡ、Ⅳ活性对比（±s） nmol/（min·mg）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05。

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3 讨论

线粒体呼吸链参与线粒体生成ATP的过程，线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是电子传递链的重要组成部分，其活性以及结构的完整性对维持机体的能量代谢至关重要。呼吸链复合物包括NADH氧化还原酶（Complex Ⅰ）、琥珀酸氧化还原酶（Complex Ⅱ）、细胞色素C氧化还原酶（ComplexⅢ）、细胞色素C氧化酶（Complex Ⅳ）。其中，Cox Ⅳ是线粒体NADH和FADH2电子传递链的末端酶，催化电子从细胞色素C转移到氧，对线粒体能量代谢有着重要的影响［7］。AMPK能够调控COX Ⅳ表达，提升线粒体的呼吸功能［8］。有氧运动训练通过补充AMPK上游信号分子apelin增加线粒体呼吸链COXⅣ蛋白表达促进线粒体能量代谢。以上说明，酶活性的高低能够直观反映线粒体呼吸功能［9-10］。廖波等［11］对中年小鼠进行了8周的高强度间歇运动训练，结果表明8周后小鼠心肌细胞线粒体呼吸链COXⅠ表达明显升高。Greggio C等［12］观察了26名健康、久坐的老年人运动4周后骨骼肌线粒体电子传递链COX及超复合物的变化，结果发现运动后COXI～Ⅳ蛋白水平均显著升高。张君实［13］通过对大鼠在力竭运动前加以不同强度的运动预适应方案，证实力竭运动可以有效减慢SD大鼠呼吸链COXⅠ、Ⅱ、Ⅳ呼吸的速率以及COXⅠ的呼吸控制率，而各强度运动的预适应手段都能提升线粒体的呼吸速率，其中中强度最明显。以上结果表明，运动能够通过改善呼吸链COX的活性来改善线粒体呼吸功能，而不同强度运动改善能力不同。

综上所述，本研究发现，CHF大鼠线粒体呼吸链复合物活性下降，中等强度运动训练能够改善CHF大鼠心肌细胞线粒体呼吸链复合物的活性，增强心肌线粒体呼吸功能，改善能量代谢，其机制可能与运动训练通过激活AMPK从而调控线粒体呼吸链复合物的活性有关。