活性氧治疗肾缺血再灌注损伤的研究进展

刘浩，王磊，陈志远，刘修恒

武汉大学人民医院泌尿外科，武汉 430060

缺血再灌注损伤是指器官和组织血供暂时中断或减少造成糖氧剥夺、营养物质缺失，引起缺血损伤，在血流恢复灌注，组织损伤进一步加重的现象。导致肾脏缺血的原因主要有心血管系统循环障碍（卒中、心肌梗死等）、夹闭肾脏血管的外科操作（肾移植、肾部分切除等）［1］。肾缺血再灌注损伤是造成急性肾损伤、延迟性肾功能恢复、供体肾脏排斥反应、慢性肾损伤等并发症的主要病因之一，也是影响公众健康问题的主要原因之一。然而，目前仍然缺乏有效的治疗手段应对缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤后由于机体抗氧化应激调控系统功能异常导致组织细胞内蓄积大量活性氧（ROS），这是介导组织再灌注损伤加重的重要原因之一。目前大量的基础和临床前研究将氧化应激损伤作为肾缺血再灌注损伤的重要机制进行药物治疗的探索［2］。

1 ROS的生成途径

在肾移植等外科手术中，血流灌注突然中断造成肾脏缺血性损伤，此阶段称之为热缺血损伤期。当氧供低于机体对氧气需求的临界值时，会造成三磷酸腺苷（ATP）生成低于维持细胞正常功能所需［3］。以上的病理基础会促使细胞进行无氧代谢，抑制有氧代谢并破坏ATP的正常产生，生成大量的ROS，最终导致氧化应激损伤［4］。

O2生成H2O的过程被认为是机体细胞通过一系列酶类催化的氧化还原反应，其本质是电子传递的过程。在氧化还原反应的过程中会产生初级自由基的中间还原代谢产物，如超氧阴离子、羟自由基以及非自由基的氧化衍生物，这些具有氧化活性的氧自由基和非自由基衍生物统称为ROS。这些产物携带有一个负电子，这个特征使其极不稳定，容易使氧自由基和非自由基衍生物易氧化其他大分子物质如蛋白质、DNA等发生相互作用［5］。ROS在细胞内的清除和蓄积之间的平衡主要依赖于抗氧化系统：①螯合过渡金属：包括铁和铜等，这些物质与H2O2发生反应并生成羟自由基（芬顿反应），因此可以通过螯合这些过渡的金属物质抑制羟自由基的产生；②抗氧化酶类：线粒体中的Mn-SOD和细胞质中的Cu/Zn-SOD等超氧化物歧化酶能够清除超氧阴离子，此外过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶能够将过氧化氢催化水解成为H2O［6］

1.1 线粒体来源ROS的生成机制 细胞内大约90%的ROS由线粒体产生。导致ROS细胞内蓄积主要原因如下：①ROS大量产生：在机体衰老、动脉粥样硬化、恶病质、细胞氧供障碍等病理因素刺激时，大量的ROS蓄积超过了细胞自身的清除能力；②抗氧化能力下降：有研究表明，肥胖患者、长期大量抽烟人群其抗氧化能力普遍下降［7］。抗氧化系统功能异常时，ROS大量蓄积在细胞内，造成生物大分子物质如DNA、蛋白质等氧化损伤，最终引起细胞功能障碍和死亡。在众多关于缺血再灌注损伤的机制研究中，线粒体作为ROS的主要来源细胞器，在调节氧化应激损伤中具有重要的作用。线粒体功能受损以及能量代谢异常也是造成肾缺血再灌注损伤的重要机制之一。在肾脏缺血阶段，氧气供应不足可直接破坏线粒体偶联，从而导致线粒体有氧代谢呼吸链中电子传递异常，引起ATP生成障碍，进一步加重ROS在细胞内蓄积［2］。

线粒体内膜主要完成ATP合成以及氧化磷酸化过程，通过复合物Ⅰ～Ⅴ、电子转运蛋白如辅酶Q和细胞色素C组成的电子传递链主要定位于线粒体内膜，其功能是介导有氧代谢完成。电子从复合物Ⅰ传递到复合物Ⅳ并伴随着线粒体内膜和基质间形成电子梯度层［8］。在这个传递过程中，1%～5%的电子会脱离正常的电子传递链形成ROS，这部分脱离电子传递链产生的ROS在细胞内会被抗氧化和解毒系统清除［9］。

肾脏缺血期间，复合物Ⅰ和Ⅲ由于组织缺氧导致其功能和活性发生改变，大量电子在传递的过程中逃逸，促使过量的ROS生成并蓄积在细胞内［10］。其中，复合物Ⅰ功能异常产生的超氧阴离子可以通过还原型/氧化型辅酶Ⅰ（NADH/NAD+）清除或高线粒体膜电位进行中和。较高的线粒体膜电位使运输电子的载体减少并且促使电子进入氧化呼吸链中，但在缺氧时线粒体膜电位也会相应地下降，间接促进超氧阴离子产生。复合物Ⅲ功能异常时，醌的氧化-还原循环会衍生出极其不稳定的半醌中间体，随着电子传递链自由移动，促进电子结合氧气分子，生成超氧阴离子［11］。当肾脏恢复高灌注后，细胞有氧代谢和过度氧合会造成线粒体复合物I和III功能损伤，反而进一步增加ROS在细胞中蓄积［4］。

1.2 非线粒体来源ROS生成的关键酶

1.2.1 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤氧化酶有两种亚型，即黄嘌呤脱氢酶和黄嘌呤氧化酶，分别可以利用NAD+和氧气作为电子受体发挥作用。黄嘌呤脱氢酶可以通过次黄嘌呤氧化生成NDAH，黄嘌呤则在尿酸中被黄嘌呤氧化酶氧化并伴随过氧阴离子的产生。肾脏缺血引起细胞ATP生成下降并促使黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化。恢复血供后，氧气和黄嘌呤氧化酶发生作用促使ROS产生并蓄积在细胞内［2］。

1.2.2 NADPH氧化酶 NADPH氧化酶（NOX）家族包括7种亚型，即NOX1-5、DUOX1和DUOX2，作用是将电子进行跨细胞膜运输。缺血再灌注损伤时，NADPH氧化酶促进ROS（主要是超氧阴离子）的生成［12］。超氧阴离子作为生成过氧化氢的原材料，在NAPDH氧化酶的催化下与其他底物发生反应最终生成具有细胞毒性的过氧化氢。NADPH氧化酶在肾组织的表达具有组织特异性，即肾组织优先表达NOX1、NOX2以及NOX4［12］。研究表明，在肾缺血再灌注损伤时，NOX4表达会显著增加并促使大量ROS的生成［13］。除了在缺血再灌注损伤发挥相应的作用，NOX4也参与调节肾慢性纤维化中ROS的生成，抑制NOX4后也能明显减缓肾梗阻性肾纤维化的进程［14］。

1.2.3 一氧化氮合成酶（NOS）NOS除了参与一氧化氮的生成外，还参与调节ROS的生成。值得注意的是，在一些特殊情况下如四氢叶酸蝶呤辅助因子缺乏、NOS单体化等，NOS活性会发生改变，可促进生成超氧阴离子［15］。有文献报道，在缺血再灌注损伤时NOS能够促进ROS的生成［4］。

2 ROS在肾缺血再灌注损伤治疗中的作用

2.1 拮抗ROS的相关通路 目前在肾缺血再灌注损伤中研究最多的拮抗ROS的信号通路包括缺氧诱导因子（HIF）与核样因子2/kelch样ECH相关蛋白1（NRF2/KEAP1）信号通路，两者在细胞应对ROS介导的氧化应激损伤时发挥重要作用。

2.1.1 HIF 细胞内大量蓄积的ROS能够激活HIF，后者使细胞内下游抗氧化应激基因激活，从而促进细胞抵抗外环境的应激损伤。

2.1.1.1 HIF的调控机制及分类 HIF是缺氧转录活性调节的关键转录因子，在缺氧条件下可以调节红细胞生成素、代谢速率、新生血管形成等生理活动［16］。在哺乳动物细胞内，HIF分为两个亚基，即氧敏感亚基HIF-α和细胞内可持续表达的HIF-β亚基。在机体细胞正常情况下，由于氧供充足HIF-α亚基被氧和铁依赖性脯氨酰羟化酶羟化，羟基化后的HIF-α能够被von Hippel-Lindau-E3泛素连接酶复合物识别并降解，因此细胞常氧情况下HIF-α保持低丰度［17］。当细胞应激如缺氧，脯氨酰羟化酶活性降低，不能催化HIF-α亚基羟基化，抑制von Hippel-Lindau-E3泛素连接酶复合物与HIF-α结合，HIF-α蛋白稳定性增加。缺氧时，核转位序列引导HIF-α进入细胞核内并与相应的β亚基二聚化，二聚体结构有利于结合到缺氧反应原件上，激活下游基因。目前为止已经发现HIF-α有三种不同的亚型，包括HIF-1α、HIF-2α以及HIF-3α。这三种不同的亚型的表达具有细胞特异性和氧气依赖性：HIF-1α几乎在一切有核细胞中表达，可能参与急性应激反应；HIF-2α在脑组织、血管内皮和Ⅱ型肺细胞中表达，主要与一些慢性反应有关；HIF-3α主要在脑、肺、心脏、肝脏以及肾脏等血供十分丰富的脏器组织表达。

2.1.1.2 HIF对ROS的调控作用 上述提到HIF信号通路在缺氧时被激活并在缺氧条件下进入细胞核内与缺氧反应元件相关的基因结合，因此有利于代谢适应和细胞生存，在肾缺血再灌注损伤过程中具有重要的意义［18］。在肾脏组织中，HIF-1α主要在上皮细胞发挥作用，HIF-2α在间质细胞和内皮细胞发挥作用［19］。缺氧持续存在的情况下，HIF-α还可以拮抗炎症反应相关通路和氧化还原通路［20］。

2.1.2 NRF2/KEAP1信号通路 NRF2主要表达和定位于细胞核内，是缺氧时被激活的主要调节基因之一，其作用是调节氧化还原稳态并与抗氧化反应元件结，调控与氧化应激相关的基因，包括谷胱甘肽S-转移酶、参与NADPH产生和血红素代谢的酶［21］。目前研究最多的关于NRF2执行其相关抗氧化应激功能的机制主要着重于NRF2/KEAP1调节系统的功能。NRF2/KEAP1信号通路在细胞受到内外环境的应激刺激如缺氧时起到增强细胞适应生存的能力，因此是组织缺氧时抵抗氧化应激损伤主要的反应元件之一。与HIF表达相似，NRF2在真核生物细胞内也持续表达，但由于细胞内具有NRF2特异性的泛素降解酶系统，保证了在细胞正常情况下只存在低水平丰度。KEAP1含有半胱氨酸硫醇，后者可感知细胞内在氧化应激时所产生的生物活性自由基，如氧自由基、羟自由基等［22］。NRF2在肾缺血再灌注损伤的灌注期间被激活，而这种应激性激活还不足以减轻氧化应激损伤，因此将NRF2作为基因治疗靶点进一步激活并上调其表达可能有助于减轻损伤。应激性的激活NRF2芮然不足以减轻缺血再灌注损时导致的氧化应激损伤，但失活或者抑制NRF2能够明显加重肾脏缺血再灌注损伤［23］。

2.2 相关药物

2.2.1 HIF信号通路激活剂 研究表明，缺血预处理可以提前激活HIF信号通路，有利于预防和治疗肾缺血再灌注损伤［24］。此外，针对HIF研发的相关激活剂有望成为有效的治疗手段，如通过铁螯合剂、铁竞争物或其他脯氨酰羟化酶抑制剂抑制铁依赖性脯氨酰羟化酶活性，能够减少HIF泛素化降解增加其蛋白稳定性。去铁胺是一种特异性的铁螯合抑制剂，常用于治疗铁过载以及β-地中海贫血，在实验动物模型中注射去铁胺能够有效地减轻缺血再灌注损伤［25］。此外，氯化钴是公认的缺氧模拟剂，主要在脯氨酰羟化酶的活性位点内与铁竞争或在膜转运蛋白水平上抑制脯氨酰羟化酶活性，从而限制铁流入。

2.2.2 NRF2信号通路激活剂 NRF2信号通路激活剂CDDO-咪唑啉、CDDO-甲酯都是三萜类化合物，能够与KEAP1的半胱氨酸残基共价结合，从而促进KEAP1与NRF2的结合。有研究证实，从肾脏缺血前24 h到肾脏缺血后24 h，CDDO-咪唑每天治疗可有效减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤，而在缺血后1 d进行1次治疗，则对小鼠肾脏损伤无显著治疗左右，其具体原因不详［26］。

ROS是缺血和再灌注期间产生的活性物质，其中线粒体作为其主要来源，在肾缺血再灌注损伤时具有重要的靶向治疗作用。同时，催化非线粒体来源ROS的关键酶如黄嘌呤氧化酶等也具有重要的药理学意义。在众多调控机制中，拮抗ROS的信号通路或者分子（HIF和NRF2/KEAP1等），无论是在动物实验水平还是在临床运用上都已做了相关研究，但由于其作用机制还不明确，因此还需要进一步的基础研究加以验证。以上研究主要集中在ROS导致的氧化应激损伤以及细胞功能障碍的理论研究，为临床实践提供了新的治疗思路。